Reglamento de vía señalización innata mieloide por MALT1 Paracaspase actividad
Summary
MALT1 regula la inmunidad innata pero cómo esto ocurre sigue siendo mal definida. Utilizamos el inhibidor selectivo de la paracaspase del MALT1 MLT-827 a desentrañar la contribución de MALT1 al innato señalización corriente abajo de los receptores de lectina-como Toll-like o tipo C, demostrando que MALT1 regula la producción de citocinas mieloide y aguas abajo de los receptores de lectina-como de tipo C, selectivamente.
Abstract
Además de su función en las células linfoides, que ha sido abordado por numerosos estudios, el paracaspase MALT1 también juega un papel importante en las células naturales aguas abajo de los receptores de reconocimiento de patrón. Mejor estudiados son los Dectin-1 y Dectin-2 miembros de la familia del lectin-como el receptor de tipo C que inducen un dependiente SYK y CARD9 señalización cascada lleva a la activación de NF-κB, en una forma dependiente de MALT1. Por el contrario, receptores tipo Toll (TLR), como TLR-4, propagar la activación de NF-κB pero la señal a través de una cascada de MYD88/IRAK-dependiente. Sin embargo, ha quedado claro si MALT1 podría contribuir a la señalización de TLR-4. Evidencia reciente con MLT-827, un inhibidor potente y selectivo de la actividad de paracaspase de MALT1, indica que TNF-producción aguas abajo de los TLR-4 en células mieloides humanas es independiente de MALT1, en contraposición a la producción de TNF abajo de Dectin-1, que es MALT1 dependiente. Aquí, nos dirigimos a la implicación selectiva de MALT1 en reconocimiento de patrones de detección adicional, usando una variedad de preparaciones celulares de ratón y humanos y estimulación de las vías Dectin-1, algunos o TLR-4. También proporcionamos perspectivas adicionales mediante la exploración de citoquinas más allá de TNF-y comparando MLT-827 a un inhibidor SYK (Cpd11) y un inhibidor de la IKK (AFN700). Colectivamente, los datos que más evidencian de la dependencia MALT1 de lectin-como el receptor tipo C, señalando por el contrario a la señalización de TLR.
Introduction
La actividad paracaspase de MALT1 (proteína 1 de desplazamiento linfoma mucosa-asociado del tejido linfoide) fue revelada en el 20081,2. Desde entonces, varios estudios han reportado su contribución crítica a las respuestas del receptor de antígeno en los linfocitos. Modelos genéticos en el ratón, así como datos de Farmacología apoyan un papel clave en las células T, autoinmunidad dependiente de células T y células B linfoma configuración3,4. En linfocitos, activación de MALT1 paracaspase ocurre a Asamblea de CARD11-BCL10-MALT1 complejo5, que se activa por antígeno receptor de señalización proximal descendente de los receptores de células T o B. También hay amplia evidencia de que un complejo similar de CARD9-BCL10-MALT1 es importante para la propagación de señales corriente abajo de los receptores de lectina-como de tipo C (CLLR), por ejemplo,, Dectin-1, Dectin-2 y algunos en mieloide de las células6,7. Dectin-1 ha sido particularmente bien estudiada porque esta vía es crítica para la defensa del huésped contra infecciones micóticas8,9. Implicación de MALT1 en vías de Toll-like receptor (TLR), sin embargo, sigue siendo controvertido10. La evidencia reciente en células mieloides humanas descartó un papel directo para MALT1 paracaspase actividad en la regulación de la producción de TNF abajo de TLR-411.
En el presente trabajo, utilizamos varios ajustes experimentales y condiciones estimulantes en humanos y células mieloides ratón para sonda innatas vías de señalización, depender de los inhibidores de la herramienta farmacológica específica y la medición de producción de citoquinas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, utilizamos simple configuración experimental para estudiar vías de señalización en humano y ratón células innatas e interrogar su dependencia en la función proteolítica MALT1. Ampliando el anterior trabajo11, nuestro estudio mostró que la actividad de paracaspase MALT1 controla c-tipo lectin-como el receptor inducido por producción de citoquinas, incluyendo el TNF-α. Por el contrario, TLR-4-inducida por el TNF-α fue independiente de MALT1 en ambas especies. Colectivame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Elsevier para su autorización (número de licencia 4334770630127) reproducir aquí figura 2A de Unterreiner et al. (2017).
Materials
| 100 µm nylon cell strainer | Sigma | CLS431752 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352057 | |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352090 | |
| 50 mL Falcon tube | Falcon | 352070 | |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid | Costar | 3595 | |
| 96 well V-bottom plate | Costar | 734-1798 | |
| Ammonium Chloride – NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Assay diluent RD1-W ELISA | R&D | 895038 | Assay diluent |
| Cell culture microplate, 384 well, black | Greiner | 781986 | |
| Depleted Zymosan | Invivogen | tlrl-dzn | now: tlrl-zyd |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO |
| EDTA-Na2 | Sigma | E5134 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate |
| ELISA muTNF-α | R&D | SMTA00 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| GM-CSF | Novartis | – | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | FBS |
| HTRF hu IL-23 | CisBio | 62HIL23PEG | |
| HTRF hu TNF-α | CisBio | 62TNFPEC | |
| HTRF reconstitution buffer | CisBio | 62RB3RDE | 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA |
| IFN-γ | R&D | L4516 | |
| IL-4 | Novartis | – | |
| Isoflurane | Abbott | Forene | |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma | L4391 | LPS used in human samples |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516 | LPS used in murine samples |
| Lysis buffer | Self-made | – | 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Magnet | Stemcell | 18001 | |
| Microplate, 384 well white | Greiner | 784075 | |
| Monocytes enrichment kit | Stemcell | 19059 | |
| Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 °C Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | cooling device (containing Propanol-2) |
| PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 | Gibco | 10010 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Pen/Strep |
| Potassium bicarbonate – KHCO3 | Sigma | P9144 | |
| PrestoBlue | Invitrogen | A13262 | Resazurin solution for viability assessment |
| Propanol-2 | Merck | 1.09634 | |
| Read buffer | MesoScale Discovery | R92TC-3 | Tris-based buffer containing tripropylamine |
| Recovery cell culture freezing medium | Gibco | 12648-010 | freezing medium |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax | Gibco | 61870 | + 10% FBS for iMoDCs + 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes + 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes |
| Separation buffer | Self-made | – | PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Trehalose-6,6-dibehenate | Invivogen | tlrl-tdb | TDB |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | Polysorbate 20 |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15675 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Viewseal sealer | Greiner BioOne | 676070 | |
| V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit | MesoScale Discovery | K15049D | electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350 |
References
- Coornaert, B., et al. T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20. Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).
- Rebeaud, F., et al. The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).
- Jaworski, M., Thome, M. The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).
- Meininger, I., Krappmann, D. Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome. Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).
- Qiao, Q., et al. Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly. Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).
- Gross, O., et al. Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity. Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).
- Chiffoleau, E. C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets. Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Taylor, P. R., et al. Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection. Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).
- Lanternier, F., et al. Primary immunodeficiencies underlying fungal infections. Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).
- Thome, M. Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation. Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).
- Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells. Immunology Letters. , 48-51 (2017).
- Strasser, D., et al. Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity. Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).
- Jaworski, M., et al. Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity. The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).
- Yu, J. W., et al. MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses. PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).
- Bardet, M., et al. The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition. Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).
- Thoma, G., et al. Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).
- Bauer, B., Steinle, A. HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch. Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).
- Gringhuis, S. I., et al. Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2. PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).
- Dufner, A., Schamel, W. W. B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model. Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).
- Phelan, J. D., et al. A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma. Nature. , (2018).
