Rensning af lav-rigelige celler i Drosophila visuelle System
Summary
Vi præsenterer her, en celle dissociation protokol for effektivt isolerer celler stede ved lav overflod i Drosophila visuelle system gennem fluorescens aktiveret celle sortering (FACS).
Abstract
Nylige forbedringer i følsomheden af næste generation sequencing har fremmet anvendelsen af transkriptom og genomisk analyser til et lille antal celler. Udnytte denne teknologi til at undersøge udviklingen i Drosophila visuelle system, som kan prale af et væld af celle type-specifikke genetiske værktøjer, giver en kraftfuld tilgang til at håndtere det molekylære grundlag af udvikling med præcise cellulære opløsning. For en sådan tilgang til at være muligt, er det afgørende at have kapacitet til at pålideligt og effektivt rense celler stede ved lav overflod i hjernen. Vi præsenterer her, en metode, der giver mulighed for effektiv rensning af enkelt celle kloner i genetiske mosaik eksperimenter. Med denne protokol opnår vi konsekvent et højt cellulære udbytte efter rensning ved hjælp af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) (~ 25% af alle mærket celler), og med held udført transcriptomics analyser på enkelt celle kloner genereret gennem mosaik analyse med en repressible celle markør (MARCM). Denne protokol er ideel til anvendelse transkriptom og genomisk analyser til bestemte celletyper i det visuelle system, på tværs af forskellige stadier af udvikling og i forbindelse med forskellige genetiske manipulationer.
Introduction
Drosophila visuelle system er en fremragende model til at studere det genetiske grundlag for udvikling og adfærd. Det består af en stereotype cellulære arkitektur1 og en avanceret genetiske toolkit til at manipulere bestemte celle typer2,3. En styrke ved dette system er evnen til selvstændigt afhøre genfunktion i celletyper af interesse med enkelt celle opløsning, ved hjælp af genetiske mosaik metoder4,5. Vi forsøgt at kombinere disse genetiske værktøjer med de seneste fremskridt i næste generation sequencing at udføre celle typespecifikke transkriptom og genomisk analyser i enkelt celle kloner i genetiske mosaik eksperimenter.
For at opnå dette, er det vigtigt at udvikle en robust og effektiv metode til at isolere selektivt lav rigelige cellepopulationer i hjernen. Tidligere, vi udviklede en protokol til isolering af specifikke celletyper i det visuelle system under puppe udvikling gennem FACS, og fastlægge deres transcriptomes ved hjælp af RNA-seq6. I disse forsøg var størstedelen af celler af en bestemt type (f.eks. R7 fotoreceptorer) fluorescently mærket. Ved hjælp af denne metode i genetiske mosaik eksperimenter, hvori kun en delmængde af celler af samme type er mærket, er lykkedes at isolere nok celler for at opnå kvalitet sequencing data. For at løse det, søgte vi at øge cellulære udbyttet ved at forbedre celle dissociation protokol.
Vores strategi var at mindske den samlede længde af protokollen for at maksimere dissocierede celler sundhed, forbedre cellulære sundhed ved at ændre dissektion og dissociation buffere, og reducere mængden af mekanisk afbrydelse af dissekerede væv. Vi testede den forbedrede protokol7 ved hjælp af mosaic analyse med en repressible celle markør5 (MARCM), som tillader generation af single fluorescently mærket kloner af bestemte celletyper, der er vildtype eller mutant for et gen af interesse i en ellers heterozygous flyve. Hvor på identiske betingelser, vores tidligere-mislykkedes at generere nok materiale til RNA-FF., var forbedret protokollen vellykket. Vi reproducerbar opnå en høj cellulære udbytte (~ 25% af mærket celler) og få høj kvalitet RNA-seq data fra så lidt som 1.000 celler7.
Et antal protokoller har været tidligere beskrevet til at isolere bestemte celletyper i Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. disse protokoller er primært beregnet til isolering af celler, der er rigelige i hjernen. Vores protokol er optimeret til at isolere lav rigelige cellepopulationer (færre end 100 celler pr. hjerne) i det visuelle system ved hjælp af FACS for efterfølgende transkriptom og genomisk analyser. Med denne protokol tilstræber vi at give en måde at reproducerbar isolere lav rigelige celler fra det flyve visuelle system af FACS og at opnå høj kvalitet transkriptom data af RNA-FF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol er enkel og ikke teknisk vanskeligt at udføre, men der er flere nøglen skridt, hvis overset vil medføre en betydelig reduktion i cellulære udbytte. (Trin 2.3.2.) Det er afgørende at kors er sund, og at maden ikke tørre ud. Regelmæssig vanding af krydser er vigtigt at maksimere antallet af fluer dissektioner, der er af den rigtige genotype og på den korrekte udviklingstrin. Hvor ofte krydser skal vandes vil variere afhængigt af maden bruges og boligforhold af fluer. At sikre krydser ikke tørre ud,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning er finansieret af NINDS af National Institutes of Health under award nummer K01NS094545, andgrants fra byens Lefler for undersøgelse af Neurodegenerative sygdomme. Vi anerkender kalkning Tan og Jason McEwan for værdifulde samtaler.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
