Drosophila दृश्य प्रणाली में कम प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं का शुद्धिकरण
Summary
यहाँ, हम प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) के माध्यम से Drosophila दृश्य प्रणाली के भीतर कम बहुतायत में मौजूद कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए एक सेल पृथक्करण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
अगली पीढ़ी sequencing की संवेदनशीलता में हाल ही में सुधार कोशिकाओं की छोटी संख्या के लिए transcriptomic और जीनोमिक विश्लेषण के आवेदन की सुविधा है. इस प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए Drosophila दृश्य प्रणाली है, जो सेल प्रकार के एक धन विशिष्ट आनुवंशिक उपकरणों का दावा में विकास का अध्ययन, सटीक सेलुलर संकल्प के साथ विकास के आणविक आधार को संबोधित करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है । इस तरह के एक दृष्टिकोण के लिए संभव है, यह करने के लिए क्षमता है मज़बूती से और कुशलता से मस्तिष्क के भीतर कम बहुतायत पर मौजूद कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम एक तरीका है कि आनुवंशिक मोज़ेक प्रयोगों में एकल कोशिका क्लोनों के कुशल शुद्धि की अनुमति देता है वर्तमान । इस प्रोटोकॉल के साथ, हम लगातार प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग कर शुद्धि के बाद एक उच्च सेलुलर उपज प्राप्त (~ सभी लेबल कोशिकाओं के 25%), और सफलतापूर्वक एक सेल के माध्यम से उत्पन्न क्लोनों पर transcriptomics विश्लेषण प्रदर्शन एक repressible सेल मार्कर (MARCM) के साथ मोज़ेक विश्लेषण । इस प्रोटोकॉल दृश्य प्रणाली में विशिष्ट कोशिका प्रकार के लिए transcriptomic और जीनोमिक विश्लेषण लागू करने के लिए आदर्श है, विकास के विभिंन चरणों के पार और विभिंन आनुवंशिक जोड़तोड़ के संदर्भ में ।
Introduction
Drosophila दृश्य प्रणाली के विकास और व्यवहार के आनुवंशिक आधार का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । यह विशिष्ट कोशिका प्रकार2,3हेर-फेर के लिए एक छवि एक सेलुलर वास्तुकला1 और एक उंनत आनुवंशिक toolkit शामिल हैं । इस प्रणाली की एक बड़ी ताकत एक सेल संकल्प के साथ ब्याज की कोशिका प्रकार में autonomously पूछताछ जीन समारोह की क्षमता है, आनुवंशिक मोज़ेक4तरीकों का उपयोग कर,5। हम अगली पीढ़ी अनुक्रमण में हाल ही में अग्रिमों के साथ इन आनुवंशिक उपकरण गठबंधन करने के लिए सेल प्रकार विशिष्ट transcriptomic और आनुवंशिक मोज़ेक प्रयोगों में एक सेल क्लोन में जीनोमिक विश्लेषण प्रदर्शन की मांग की ।
यह पूरा करने के लिए, यह एक मजबूत और कारगर तरीका चुन कर मस्तिष्क में कम प्रचुर मात्रा में कोशिका आबादी को अलग विकसित करने के लिए आवश्यक है । पहले, हम FACS के माध्यम से pupal विकास के दौरान दृश्य प्रणाली में विशिष्ट कोशिका प्रकार अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है, और आरएनए-seq6का उपयोग कर अपने transcriptomes का निर्धारण. इन प्रयोगों में, एक विशेष प्रकार की कोशिकाओं के विशाल बहुमत (जैसे R7 photoreceptors) फ्लोरोसेंट लेबल थे. इस विधि का प्रयोग, आनुवंशिक मोज़ेक प्रयोगों में, जिसमें केवल एक ही प्रकार की कोशिकाओं का एक सबसेट लेबल कर रहे हैं, हम गुणवत्ता अनुक्रमण डेटा प्राप्त करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को अलग करने में विफल. इस पते के लिए, हम सेल पृथक्करण प्रोटोकॉल में सुधार के द्वारा सेलुलर उपज बढ़ाने की मांग की ।
हमारे दृष्टिकोण असंबद्ध कोशिकाओं के स्वास्थ्य को अधिकतम करने के लिए प्रोटोकॉल की कुल लंबाई कम करने के लिए किया गया था, विच्छेदन और पृथक्करण बफ़र्स फेरबदल करके सेलुलर स्वास्थ्य में सुधार, और विच्छेदित ऊतक को यांत्रिक विघटन की मात्रा को कम. हम बेहतर प्रोटोकॉल का परीक्षण7 एक repressible सेल मार्कर के साथ मोज़ेक विश्लेषण का उपयोग कर5 (MARCM) है, जो विशेष रूप से सेल प्रकार के एकल फ्लोरोसेंट लेबल क्लोन की पीढ़ी की अनुमति देता है, कि जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती ब्याज की एक जीन के लिए कर रहे है में एक अन्यथा heterozygous मक्खी. जहां, समान शर्तों के तहत, हमारे पहले प्रोटोकॉल आरएनए-seq के लिए पर्याप्त सामग्री उत्पन्न करने में विफल रहा, बेहतर प्रोटोकॉल सफल रहा । हम एक उच्च सेलुलर उपज प्राप्त reproducibly (~ लेबल कोशिकाओं के 25%) और उच्च गुणवत्ता आरएनए-seq डेटा प्राप्त करने के रूप में कम से १,००० कोशिकाओं7।
कई प्रोटोकॉल पहले Drosophila6,8,9,10,11,12,13 में विशेष कक्ष प्रकारों को अलग करने के लिए वर्णन किया गया है , 14 , 15 , 16. इन प्रोटोकॉल ज्यादातर कोशिकाओं है कि मस्तिष्क के भीतर प्रचुर मात्रा में है अलग करने के लिए इरादा कर रहे हैं । हमारे प्रोटोकॉल को अलग करने के लिए अनुकूलित है कम प्रचुर मात्रा में सेल (मस्तिष्क प्रति १०० कोशिकाओं से कम) दृश्य प्रणाली में बाद में transcriptomic और जीनोमिक विश्लेषण के लिए FACS का उपयोग कर । इस प्रोटोकॉल के साथ, हम FACS द्वारा फ्लाई दृश्य प्रणाली से कम प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं को अलग reproducibly और आरएनए-seq द्वारा उच्च गुणवत्ता transcriptome डेटा प्राप्त करने के लिए एक रास्ता प्रदान करने के लिए लक्ष्य ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल सरल और तकनीकी रूप से लागू नहीं मुश्किल है, लेकिन वहां कई महत्वपूर्ण कदम है कि अगर अनदेखी सेलुलर उपज में काफी कमी का कारण होगा रहे हैं । (स्टेप 2.3.2.) यह महत्वपूर्ण है कि पार स्वस्थ हैं, और है कि ख?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध में पुरस्कार संख्या K01NS094545 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के NINDS, Neurodegenerative विकारों के अध्ययन के लिए Lefler केंद्र से andgrants को वित्त पोषित किया गया. हम मूल्यवान बातचीत के लिए चूने टैन और जेसन McEwan स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
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