Rensing av lav-rikelig celler i Drosophila visuelle systemet
Summary
Her presenterer vi en celle dissosiasjon protokoll for effektivt å isolere celler på lav overflod i Drosophila visuelle systemet gjennom fluorescens aktivert celle sortering (FACS).
Abstract
Siste forbedringer i følsomheten av neste generasjons sekvensering lettet anvendelse av transcriptomic og genomisk analyser til lite antall celler. Bruk denne teknologien for å studere utviklingen i Drosophila visuelle systemet, som har et vell av celle type-spesifikk genetisk verktøy, gir en kraftig tilnærming for adressering molekylær grunnlaget for utvikling med presis mobilnettet oppløsning. For en slik tilnærming være gjennomførbart, er det avgjørende å ha kapasitet til å pålitelig og effektivt renser celler på lav overflod i hjernen. Her presenterer vi en metode som gir effektiv rensing av enkeltcelle kloner i genetisk mosaikk eksperimenter. Med denne protokollen oppnår vi konsekvent en høy mobilnettet avkastning etter rensing med fluorescens aktivert celle sortering (FACS) (~ 25% av alle merkede celler), og hell utføres transcriptomics analyser på enkeltcelle kloner generert gjennom mosaikk analyse med merketråd repressible celle (MARCM). Denne protokollen er ideelle for bruk transcriptomic og genomisk analyser på spesifikke celletyper i visuelle systemet, på ulike stadier av utvikling og i forbindelse med ulike genetisk manipulasjon.
Introduction
Det visuelle systemet Drosophila er en fremragende modell for å studere genetisk grunnlag av utvikling og atferd. Det består av en stereotype mobilnettet arkitektur1 og en avansert genetisk verktøykasse for å manipulere bestemt celle typer2,3. En stor styrke for dette systemet er muligheten til selvstendig forhøre gen funksjon i celletyper interesse med enkeltcelle oppløsning, bruker genetisk mosaikk metoder4,5. Vi søkt å kombinere disse genetiske verktøy med nylige fremskritt innen neste generasjons sekvensering å utføre celle type-spesifikk transcriptomic og genomisk analyser i enkelt celle kloner genetisk mosaikk eksperimenter.
Dette er det viktig å utvikle en robust og effektiv metode for å isolere selektivt lav rikelig celle populasjoner i hjernen. Tidligere har utviklet vi en protokoll for å isolere spesifikke celletyper i visuelle systemet under pupal utvikling gjennom FACS, og bestemme deres transcriptomes ved hjelp av RNA-seq6. I disse eksperimentene, ble det store flertallet av celler av en bestemt type (f.eks R7 fotoreseptorer) fluorescently merket. Benytter denne metoden, genetisk mosaikk eksperimenter, der bare et delsett av celler av samme type er merket, kunne vi isolere nok celler for å få kvalitet sekvensering data. For å løse dette, søkt vi å øke cellulære avkastningen ved å forbedre celle dissosiasjon protokollen.
Vår tilnærming var å redusere den totale lengden av protokollen for å maksimere helse dissosiert celler, forbedre cellulære helse ved å endre disseksjon og dissosiasjon buffere og redusere mekanisk avbrudd til dissekert vev. Vi testet forbedret protokollen7 bruker mosaikk analyse med en repressible celle markør5 (MARCM), som tillater generering av fluorescently merket kloner av bestemt celletyper, vill type eller mutant for et genet av interesse i en ellers heterozygote fly. Der, under like, våre tidligere protokollen kunne generere nok materiale til RNA-seq, var forbedret protokollen vellykket. Vi reproduserbar oppnå en høy mobilnettet avkastning (~ 25% merket celleområde) og hente høykvalitets RNA-seq data fra så lite som 1000 celler7.
Flere protokoller har vært beskrevet tidligere for å isolere bestemte celletyper i Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. disse protokollene er hovedsakelig ment for å isolere celler som er rikelig i hjernen. Våre protokollen er optimalisert for å isolere lav rikelig celle populasjoner (færre enn 100 celler per hjernen) i visuelle systemet bruker FACS for etterfølgende transcriptomic og genomisk analyser. Med denne protokollen, som mål å tilby å isolere reproduserbar lav rikelig celler fra fly visuelle systemet av FACS og få høykvalitets transcriptome data av RNA-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen er enkel og ikke teknisk vanskelig å gjennomføre, men det er flere viktige trinn som hvis oversett vil føre til en betydelig reduksjon i mobilnettet avkastning. (Trinn 2.3.2.) Det er avgjørende at kors er sunn, og at maten ikke tørke. Vanlig vanning av kors er viktig å maksimere antall fluer tilgjengelig for disseksjon som høyre genotype og riktig utviklingstrinn. Hvor ofte krysser måtte bli vannet varierer maten brukes og boforhold Fluenes. For å sikre krysser ikke tørke ut, undersøke hetteg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble finansiert av NINDS av National Institutes of Health prisen nummer K01NS094545, andgrants fra Lefler senter for studier av nevrodegenerative lidelser. Vi erkjenner kalking Tan og Jason McEwan for verdifulle samtaler.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
