Här presenterar vi ett cell dissociation protokoll för effektivt isolera celler närvarande vid låg överflöd inom Drosophila visuella systemet genom fluorescens aktiverad cell sortering (FACS).
Senaste förbättringar av känsligheten av nästa generations sekvensering har underlättat tillämpningen av transcriptomic och genomiska analyser på litet antal celler. Utnyttja denna teknik för att studera utvecklingen i Drosophila visuella systemet, som ståtar med en mängd cell typspecifika genetiska verktyg, ger en kraftfull metod för att hantera den molekylära basen för utveckling med precisa cellulära upplösning. För en sådan vara genomförbart, är det viktigt att ha kapacitet att tillförlitligt och effektivt rena celler närvarande vid låg överflöd i hjärnan. Här presenterar vi en metod som möjliggör effektiv rening av enstaka cell kloner i genetiska mosaik experiment. Med detta protokoll uppnå vi konsekvent en hög cellulära avkastning efter rening med hjälp av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) (~ 25% av alla märkta celler), och framgångsrikt utfört transkriptomik analyser på enstaka cell kloner genereras genom Mosaic analys med en repressible cell markör (MARCM). Detta protokoll är idealisk för att applicera transcriptomic och genomiska analyser till specifika celltyper i det visuella systemet, över olika stadier av utveckling och inom ramen för olika genetiska manipulationer.
Drosophila visuella systemet är en enastående modell för att studera den genetiska grunden för utveckling och beteende. Den består av en stereotyp cellulära arkitektur1 och en avancerad genetisk toolkit för att manipulera specifika cell typer2,3. En stor styrka med detta system är förmågan att självständigt förhöra geners funktion i celltyper sevärdheter med enstaka cell upplösning, använder genetiska mosaik metoder4,5. Vi försökt kombinera dessa genetiska verktyg med senaste framstegen inom nästa generations sekvensering att utföra cell typspecifika transcriptomic och genomiska analyser i enskild cell kloner i genetiska mosaik experiment.
För att åstadkomma detta, är det nödvändigt att utveckla en robust och effektiv metod för att isolera selektivt låga riklig cellpopulationer i hjärnan. Tidigare har utvecklat vi ett protokoll för att isolera specifika celltyper i det visuella systemet under Pupp utveckling genom FACS, och avgöra deras transcriptomes som använder RNA-seq6. I dessa experiment, var den stora majoriteten av celler av en viss typ (t.ex. R7 fotoreceptorer) fluorescently märkt. Med den här metoden i genetiska mosaik experiment, där endast en delmängd av celler av samma typ är märkta, misslyckats vi med att isolera tillräckligt med celler för att få kvalitet sekvensering data. För att lösa detta, försökte vi öka cellulär avkastningen genom att förbättra cell dissociation protokollet.
Vår strategi var att minska den totala längden av protokollet att maximera hälsa dissocierade celler, förbättra cellulär hälsa genom att ändra dissektion och dissociation buffertar, och minska den mekaniska störningar i dissekerade vävnad. Vi testade den förbättra protokoll7 med hjälp av mosaic analys med en repressible cell markör5 (MARCM), som tillåter generation av enkel fluorescently märkt kloner av speciella celltyper, som vildtyp eller mutant för en gen av intresse i en annars heterozygot fluga. Där, under identiska förhållanden, vår tidigare protokoll misslyckades med att generera tillräckligt med material för RNA-seq, var förbättrad protokollet framgångsrik. Vi reproducibly uppnå en cellernas kickavkastning (~ 25% av märkt celler) och få hög kvalitet RNA-seq data från så lite som 1000 celler7.
Ett antal protokoll har beskrivits tidigare för att isolera särskilda celltyper i Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. dessa protokoll är främst avsedda för att isolera cellerna som finns i överflöd i hjärnan. Våra protokoll är optimerad för att isolera låg rikligt cellpopulationer (färre än 100 celler per hjärnan) i det visuella systemet med FACS för efterföljande transcriptomic och genomiska analyser. Med detta protokoll, vi strävar efter att ge ett sätt att isolera reproducibly låg rikligt celler från FACS och erhålla högkvalitativ transkriptom data av RNA-följande punkter flyga visuella systemet
Detta protokoll är enkel och inte tekniskt svår att utföra, men det finns flera viktiga steg som om förbises kommer att orsaka en betydande minskning av cellulära avkastning. (Steg 2.3.2.) Det är avgörande att korsar är friska och att maten inte torkar ut. Regelbunden vattning av korsar är viktigt att maximera antalet flugor tillgängliga för dissektion som är av rätt genotyp och i rätt skede av utveckling. Hur ofta korsar behöver vattnas varierar beroende på den mat som används och inhysa villkorar av fl…
The authors have nothing to disclose.
Forskningen finansierades av NINDS av det nationella Institutes of Health award nummer K01NS094545, andgrants från Lefler Center för den studie av neurodegenerativa sjukdomar. Vi erkänner kalkning Tan och Jason McEwan för värdefulla samtal.
Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
Papain | Worthington | LK003178 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |