Комбинированные капсид генетических и химические изменения векторов на основе аденовирус перенос генов для экранирования и ориентации
Summary
Протокол, описанные здесь позволяет исследователям специально изменить аденовирусной capsids на отдельных участках путем простой химии. Экранированный аденовирус векторные частиц и перенацелены гена передачи векторов может быть создан, и вектор хост взаимодействия могут быть изучены.
Abstract
Аденовирусы векторы являются мощным инструментов для генетических вакцинации и онколитического Виротерапии. Однако они склонны к несколько нежелательных вектор хост взаимодействия, особенно после доставки в естественных условиях . Это консенсус, что ограничения, накладываемые взаимодействия нежелательных вектор хост может только быть преодолены, если выполняются определенные модификации поверхности вектор. Эти изменения включают в себя защитные частиц от нежелательных взаимодействий и путем введения новых лигандов. Цель Протокола, представленные здесь является возможность читателю сформировать экранированные и, при желании, перенацеленных векторов передачи гена человека аденовируса или онколитического вирусов. Протокол позволит исследователям для изменения поверхности аденовирус вектор capsids путем конкретных химических вложения синтетических полимеров, углеводы, липиды, или других биологических или химических постановление. Она описывает передовые технологии комбинированных капсид генетических и химических модификаций, которые показали, чтобы облегчить понимание и преодоление барьеров для доставки в vivo аденовирус векторов. Приводится подробное и прокомментировал описание важнейших шагов для выполнения конкретных химических реакций с биологически активные вирусы или вирус производных векторов. Технологии, описанные в протокол основан на генетическое введение (естественно отсутствуют) цистеина остатков в подвергшихся воздействию растворителей петли аденовирусной производных векторов. Этих видов остатков цистеина обеспечивают конкретные химической активности, которые могут после производства векторов на высокие титры, быть использованы для весьма конкретных и эффективных ковалентной химической сцепления молекул из самые разнообразные вещества классов в вектор частицы. Важно отметить, что этот протокол может быть легко адаптирована выполнять широкий спектр различных (не тиоловых основе) химических модификаций аденовирус вектора capsids. Наконец это скорее всего что-оболочечных вирусов на основе гена векторов передачи отличных аденовирусы могут быть изменены на основе этого протокола.
Introduction
Аденовирусов (Ad), члены семьи аденовирусы, являются не охватило ДНК вирусов, из которых более 70 типов до настоящего времени были определены (http://hadvwg.gmu.edu). В зависимости от свойства hemaglutination, структура генома и результаты секвенирования типы 70 объявлений можно разделить на семь видов (человека аденовирусов A-G)1,2. Геном человека Ad-38 kb в размер и инкапсулируется икосаэдра нуклеокапсидом3. Из-за их изобилия капсида белка hexon, Пентон базы и волокна все называются основных капсульных белков. Самые обильные и капсульных белков hexon формирует 20 капсид грани, каждая из которых состоит из 12 hexon homotrimers4,5. Пентон, расположенных на каждой грани икосаэдра (вершина), состоит из pentamers Пентон базы и представляет базу для вершины пика, построенный гликозилированного волокна тримеры5,6. Родной Ad ячейку записи в основном состоит из двух основных шагов. Во-первых ручку волокна связывается с основным рецепторами. В типы объявлений от видов A, C, E и F это Коксаки и аденовирус рецептор (автомобиль). Это взаимодействие приносит вирионов в spatial близости поверхности клетки, способствуя тем самым взаимодействие между сотовой интегринов и РГД мотив в Пентон базы и следовательно заставить клеточных реакций. Во-вторых изменения цитоскелета привести к интернализации вириона и транспорта endosome7. После частичной разборки в endosome вириона выпущен в цитоплазму und в конечном итоге путешествия к ядру для репликации.
Хотя объявление может быть доставлено локально (например., генетических вакцинации), системные поставки через кровь, необходимые для онко Виротерапии стоят несколько препятствий. Во время циркулирует в крови, вводят вирионы сталкиваются системы обороны хозяина иммунной системы, приводит к быстрой нейтрализации вируса основе векторов и рендеринга Ad основе векторов крайне неэффективно в системных приложений. Кроме того естественный hepatotropism Ad вмешивается Системные поставки и должны быть решены для перенаправления объявления своих новых клеток-мишеней.
Кодировке микрофлорой природных антитела IgM врожденной иммунной системы быстро узнают и связывают повторяющихся структур на поверхности вириона8,9. Эти иммунных комплексов затем активировать классических и неклассических пути системы комплемента, ведущих к быстро дополнение опосредованной нейтрализации большую часть вирионы8. Второй путь, что приводит к крупным удаления Ad вирионов опосредовано макрофаги10 и связанные с острой токсичных и гемодинамическими побочные эффекты11,12. В случае объявления в частности, Купфера клетки, проживающих в печени привязку и phagocytically занять Ad вирионы через рецепторы конкретных мусорщика, тем самым устраняя их от крови13,14,15 . Также были определены конкретные мусорщик рецепторов печени синусоидального эндотелиальных клеток (LSE)16, и LSE клетки, как представляется, также способствуют ликвидации вектор17, но в какой степени все еще нуждается в уточнении. Кроме того некоторые типы объявлений и их производных векторов эффективно изолированы в эритроцитах человека18 которой они связывают через автомобиль или дополнения рецепторов CR119. Следует отметить это секвестирующим механизм не могут быть изучены в системе модель мыши как контраст в эритроцитах человека, мыши эритроцитов не Экспресс автомобилей.
Специфические антитела анти объявлений, порожденных адаптивной иммунной системы после воздействия на ад, либо из-за предыдущей инфекции с Ad или после первых родов в системных приложений поднять еще препятствием для эффективного использования Ad векторов, и они должны быть уклонился в Системные эффективности.
Наконец сильный hepatotropism некоторые типы объявлений (включая Ad5) серьезно затрудняет применение Ad в системной терапии. Этот тропизма, что приводит к трансдукции гепатоцитов объясняется высоким сродством вириона Ad на фактор свертывания крови X (FX), опосредованного взаимодействия FX с21,20,Ad hexon белок22. FX мосты вириона для гепарина гликанов сульфат (HSPGs) на поверхности гепатоцитов20,23,24,25. Решающим фактором для этого взаимодействия, как представляется, быть конкретной степени N – и O-сульфатация HSPGs в клетки печени24, который отличается от HSPGs на других типах клеток. Помимо этого пути FX-опосредованной последние исследования показывают, дальнейшие пути пока не определены, в результате объявления трансдукции гепатоцитов26,27,28.
Недавно это было показано что FX участвует не только в гепатоцитов трансдукции Ad, но также путем привязки, вириона щиты частицы вируса против нейтрализации системы комплемента26. Сокращение трансдукции гепатоцитов, предотвращая FX привязки, таким образом, создаст нежелательный побочный эффект увеличения Ad нейтрализации через иммунной системы.
Глубокое знание сложных взаимодействий между векторами и принимающих организмов, поэтому необходимо разработать более эффективные векторов для системных приложений, которые обойти препятствия, введенные в организм хозяина.
Одна стратегия, которая первоначально использовалась для терапевтических белков был адаптирован для Ad векторов для по крайней мере частично преодолеть барьеры, описанных выше. Антигенностью и иммуногенности терапевтического белковых соединений может быть уменьшена Муфта полиэтилен гликоль (PEG)29,30. Следовательно ковалентных муфта полимеры, такие как привязка или поли [N-(2-гидроксипропил) methacrylamid] (pHPMA) к капсидному поверхности щиты вектор от нежелательных вектор хост взаимодействий. Обычно полимерные муфты цели ε-аминов группы остатков лизина стороне, которые распределяются случайным образом на поверхность капсида. Вектор частицы в растворе благодаря гидрофильной природы прилагаемый полимеров, окружены стабильного водной оболочки, что снижает риск признания иммунных клеток или энзимной деградации. Кроме того объявление Пегилированный векторов были продемонстрированы обойти нейтрализация анти hexon антител в пробирке и в предварительно иммунизированной мыши в vivo31. В отличие от изменения генетической капсида химические соединения полимеров выполняется после производства и очистки, что позволяет не только для использования обычных продюсер клеток и производство высокого титра вектор запасов, но и для синхронного модификация тысячи аминокислот на поверхность капсида. Однако Амин направленных экранирование происходит случайным образом на протяжении всего капсид поверхности, что приводит к высокой неоднородностей и не позволяя для изменения определенных capsomers. Кроме того постановление большой полимера, необходимых для благотворно влиять вирус отпорности32.
Чтобы преодолеть эти ограничения, Kreppel и др. 33 представил концепцию geneti химические для векторных ре – и ненацеливание. Генетически, которым были введены в вирус капсид воздействию растворителей позиции как волокна HI-петля33, белок IX34и35,hexon36. Хотя не встречающиеся, хвоща подшипник Ad векторов может производиться на высокие титры в клетках нормального производителя. Главное вставки которым в некоторых capsomers и в разных позициях в пределах одного capsomer позволяет для весьма конкретных модификаций тиоловых групп реактивной постановление. Для преодоления многочисленных препятствий в дизайн вектор объявление было показано этот geneti химический подход. Сочетание на основе Амин ПЭГилирование ненацеливание и на основе тиоловых муфта трансферрина на ручку волокна, которую HI-цикла было доказано, чтобы успешно переориентировать изменение Ad векторов для автомобилей недостаточным клетки33. Поскольку hexon участвует в самых нежелательных взаимодействий (нейтрализующих антител, фактор свертывания крови FX), на основе тиоловых изменения стратегии были также применяется к hexon. Сцепка небольшой КОЛЫШЕК постановление HVR5 hexon предотвратить объявление вектор частицы передают SKOV-3 клетки присутствии FX, тогда как большие PEG постановление увеличились гепатоцитов трансдукции14,35. Объявление вектор частицы, перевозящих мутации в ручку волокна, ингибирующих автомобилей привязки и HVR7 ингибирования привязки FX (и которым подшипник вставлен в HVR1 для позиции конкретного ПЭГилирование) были продемонстрированы уклониться от опосредованной антителами и дополнения нейтрализации, а также мусорщик рецептор опосредованный поглощения без потери инфекционности. Интересно, что несмотря на отсутствие естественных щит FX, ПЭГилирование снова улучшены трансдукции гепатоцитов как функция PEG размер36. Однако было показано, что ковалентной экранирование повлиять на внутриклеточные процессы торговли людьми. Prill и др. по сравнению необратимым против щитов bioresponsive на основе pHPMA и продемонстрировали, что ни режим экранирования, ни Кополимер заряда сказались на ввод в ячейку, но влияет на частицы людьми к ядру. Используя bioresponsive щит с положительно заряженные pHPMA сополимеры допускается для частиц людьми в ядро, поддержание высоких трансдукции эффективность объявлений векторы37 in vitro и in vivo.
Таким образом эти данные свидетельствуют о том, даже при условии, что все вектора хост взаимодействия были известны и считается, чрезмерное капсид поверхностных модификаций необходимо преодолеть препятствия, связанные с доставкой системные вектора.
Здесь мы предоставляем протокол для выполнения конкретных химических модификаций аденовирус вектор capsids для экранирования или переназначение аденовирус вектор частиц и вирусов на базе аденовирусной онколитического. Концепция этой технологии приводится на рисунке 1. Это позволяет, экранирование некоторых регионах капсид от нежелательных взаимодействий ковалентных вложения синтетических полимеров. В то же самое он также предоставляет средства для присоединения лигандов и объединить экранирование и ориентации. С помощью простых химии, экспериментаторов смогут ковалентно изменить аденовирус вектор поверхности с широкий спектр молекул включая пептиды/белки, углеводы, липиды и других малых молекул. Кроме того протокол предусматривает общую концепцию химической модификации биологически активных вирус производных векторов при поддержании их биологической целостности и деятельности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эффективность, в которой генетически введено которым можно изменять химически обычно составляет 80-99%, и определенные переменные влияют на эту эффективность. Во-первых важно, что генетически введено которым не проходят преждевременной окисления. Будучи хорошо защищен в условиях снижен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
References
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, 570-573 (1953).
- van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
- Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
- Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
- Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
- Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
- Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
- Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
- Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
- Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
- Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
- Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
- Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
- Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
- Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
- Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
- Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
- Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
- Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
- Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
- Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
- Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
- Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
- O’Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
- Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
- Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
- Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
- Prill, J. -. M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
- Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. , 377-388 (2017).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).
