הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרים במיוחד לשנות capsids אדנו-אתרים נבחרים על-ידי כימיה פשוטה. אדנו מסוככים את המומנט חלקיקים וקטורים העברת גנים retargeted יכול להיווצר ו החרקי המארח יכול להילמד.
אדנו וקטורים הם כלי חזק virotherapy חיסון, oncolytic גנטית. עם זאת, הם נוטים אינטראקציות מרובות וקטור רצויה-מארח, במיוחד לאחר הלידה ויוו . זה קונצנזוס כי המגבלות שהוטלו על ידי אינטראקציות וקטור רצויה-המארח יכול רק להתגבר אם מתבצעים שינויים מוגדר של המשטח וקטור. שינויים אלה כוללים מיגון של החלקיקים של אינטראקציות בלתי רצויים פילוח לפי המבוא של ליגנדים חדש. המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא לאפשר לקורא להפיק ממוגן, אם רצונך בכך, retargeted וקטורים העברת גנים אדנו אנושי או וירוסים oncolytic. הפרוטוקול יאפשר לחוקרים לשנות את פני השטח של capsids וקטור אדנו על-ידי מצורף כימי מסוים של פולימרים סינתטיים, פחמימות, שומנים או אחרים moieties ביולוגי או כימי. היא מתארת את טכנולוגיה חדשנית של שינויים capsid גנטי וכימי משולב, אשר הוכחו כדי להקל על ההבנה, התגברות על מחסומים עבור משלוח ויוו אדנו וקטורים. תיאור מפורט של תגובות של צעדים חיוניים לביצוע תגובות כימיות ספציפיות עם וירוסים פעילים ביולוגית או וירוס-derived וקטורים מסופק. הטכנולוגיה שמתואר הפרוטוקול מבוסס על המבוא גנטי של ציסטאין (נעדר באופן טבעי) שאריות לתוך החשופים הממס לולאות של אדנו-derived וקטורים. אלה שאריות ציסטאין לספק כימיים תגובתיות ספציפי, זה יכול, לאחר הייצור של הווקטורים כדי titers גבוהה, תנוצל ספציפי מאוד ויעיל צימוד כימי קוולנטיות של מולקולות מתוך מגוון רחב של מחלקות חומר כדי וקטור חלקיקי. חשוב לציין, פרוטוקול זה ניתן בקלות להתאים לבצע מגוון רחב של שונות (שאינה תיול מבוססת) שינויים כימיים של וקטור אדנו capsids. בסופו של דבר, זה סביר וקטורים העברה הזה שאינו אפוף ג’ין מבוסס-וירוס אחר ממה אדנו ניתן לשנות מן הבסיס של פרוטוקול זה.
Adenoviruses (Ad), בני משפחת Adenoviridae, הם שאינו אפוף וירוסי דנ א של יותר מ-70 סוגים אשר עד כה מזוהה (http://hadvwg.gmu.edu). בהתאם hemaglutination מאפיינים, מבנה הגנום ותוצאות רצף, ניתן לחלק את סוגי 70 לספירה שבעת המינים (האנושית adenoviruses A עד G)1,2. הגנום האנושי מודעה בגודל של 38 kb, כמוס icosahedral nucleocapsid3. בשל שפע שלהם, capsid חלבון קללה, זה בסיס פנטון, סיבים כל מכונים capsid הגדולות חלבונים. שופע והגדול ביותר capsid חלבון קללה, זה יוצר היבטים capsid 20, שכל אחד מהם מורכב של 12 קללה, זה homotrimers4,5. פנטון, הממוקם בקצה כל icosahedral (קודקוד), מורכב pentamers של הבסיס פנטון ומייצג את הבסיס טינה קודקוד הבנוי של glycosylated סיב trimers5,6. ערך מקורי של תא לספירה מורכב בעצם שני שלבים עיקריים. ראשית, הידית סיבים נקשר לקולטן העיקרי. המודעה סוגי זנים A, C, E ו- F, זהו הקולטן coxsackie, אדנו (מכונית). אינטראקציה זו מביא את virion לתוך קרבה מרחבית את פני השטח של התא, ובכך להקל על אינטראקציות בין הסלולר אינטגרינים מוטיב RGD פנטון הבסיס, כתוצאה מכך גרימת תגובות הסלולר. שנית, להוביל לשינויים שלד התא הפנמה של virion ושל התחבורה ביותר אנדוזום7. בעת פירוק חלקי ב אנדוזום, virion הוא שוחרר אל הציטופלסמה und בסופו של דבר עובר את הגרעין לצורך שכפול.
בעוד המודעה יכולה להיות מועברת באופן מקומי (למשל., לקבלת חיסון גנטי), מערכתי משלוח דרך מחזור הדם כנדרש על onco-virotherapy פונה מספר מחסומים. בעוד במחזור הדם, virions מוזרק נתקלים מערכת ההגנה של מערכת החיסון של המחשב המארח, שמוביל נטרול מהיר של הווקטורים מבוסס-וירוס ובעיבוד וקטורים המבוסס על המודעה יעיל מאוד ביישומים מערכתית. יתר על כן, hepatotropism הטבעית של Ad מפריע משלוח מערכתית, חייבות להיפתר לנתב מחדש המודעה שלה התאים היעד החדש.
מקודד Germline נוגדנים IgM הטבעית של מערכת החיסון המולדת במהירות מזהה, לאגד מבנים מאוד חוזרות על פני8,virion9. אלה מכלולי המערכת החיסונית ואז להפעיל את המסלולים קלאסית וקלאסי של מערכת המשלים, שמוביל מהר המשלים בתיווך ניטרול של חלק גדול virions8. שביל השנייה וכתוצאה מכך הסרת העיקריים של Ad virions מתווכת על-ידי מקרופאגים10 , המשויך חריפה ולא הקרדיאלי תופעות לוואי11,12. במקרה של המודעה בפרט, Kupffer תאים המתגוררים הכבד לאגד ולהתחיל phagocytically Ad virions ויה נבלות ספציפי הקולטנים, ובכך לחסל אותם מן הדם13,14,15 . קולטנים ספציפיים נבלות גם זוהו תאי אנדותל sinusoidal הכבד (LSE תאים)16, ונראה LSE תאים גם תורמת וקטורית חיסול17, אלא באיזו מידה עדיין צריך הבהרה. יתר על כן, חלק מסוגי לספירה ווקטורים נגזר שלהם הם ביעילות מבודדות על ידי האדם אריתרוציטים18 שאליו הם לוחצים באמצעות מכונית או הקולטן המשלים CR119. ראוי לציין, מנגנון sequestering זה לא ניתן לחקור במערכת מודל העכבר כמו בניגוד אריתרוציטים אנושי, אריתרוציטים העכבר לא מבטא את המכונית.
נוגדנים ספציפיים נגד לספירה שנוצר על ידי מערכת החיסון מסתגלת לאחר חשיפה לספירה עקב זיהומים הקודם עם המודעה או או לאחר המשלוח הראשון ביישומים מערכתית הרימו מכשול נוסף לשימוש יעיל של וקטורים לספירה, הם צריכים להיות התחמק ב משלוח מערכתית יעילה.
לבסוף, hepatotropism חזק המודעה בסוגים מסוימים (כולל Ad5) קשות מעכבת היישום של המודעה בטיפול מערכתי. זה tropism וכתוצאה מכך hepatocyte התמרה חושית הוא בזיקה גבוהה של virion המודעה כדי דם קרישה פקטור X (FX), מתווכת על ידי האינטראקציה של FX עם Ad קללה, זה חלבון20,21,22. FX מגשרת את virion כדי הפרין סולפאט glycans (HSPGs) על פני hepatocytes20,23,24,25. גורם מכריע עבור אינטראקציה זו נראה במידה מסוימת של N -, O-sulfation של HSPGs תאי כבד24, אשר היא נבדלת HSPGs על סוגי תאים אחרים. בנוסף מסלול זה בתיווך FX, מחקרים שנעשו לאחרונה מראים עוד יותר מסלולים עדיין לא זיהו כי התוצאה ב- Ad התמרה חושית של hepatocytes26,27,28.
לאחרונה, הוכח כי FX לא רק מעורב hepatocyte התמרה חושית של Ad, אך גם על-ידי איגוד, שילדס virion החלקיק וירוס נגד ניטרול על ידי מערכת המשלים26. הפחתה של התמרה חושית hepatocyte על-ידי מניעת איגוד FX, לכן, ליצור תופעת לוואי בלתי רצויות של הגדלת לספירה ניטרול באמצעות מערכת החיסון המולדת.
ידיעה עמוקה של אינטראקציות מורכבות בין וקטורים ואורגניזמים מארח ולכן יש צורך לפתח וקטורים יעיל יותר עבור יישומים מערכתית לעקוף את המכשולים שהוטלו על ידי האורגניזם של המחשב המארח.
אסטרטגיה אחת שבה השתמשו במקור חלבונים טיפולית כבר מותאם לספירה וקטורים לפחות חלקית להתגבר על המחסומים שתואר לעיל. Antigenicity ו- immunogenicity של תרכובות טיפולית חלבון יכול להיות מופחת על ידי צימוד כדי פוליאתילן גליקול (PEG)29,30. לפיכך, המושבים קוולנטיות של פולימרים כגון פג או פולי [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid] (pHPMA) כדי capsid השטח ומגנים הווקטור של אינטראקציות וקטור לא רצויים-המארח. בדרך כלל, פולימר צימוד מטרות חדוה-אמין קבוצות מכל שאריות בצד ליזין המופצים באופן אקראי על פני capsid. וקטור חלקיקים בתמיסה, בשל אופיו הידרופילית משושמים המצורפת, מוקפים פגז מים יציבים זה מפחית את הסיכון של תאים חיסוניים הכרה או השפלה אנזימטיות. יתר על כן, וקטורים PEGylated לספירה הוצגו להתחמק ניטרול באמצעות אנטי-קללה, זה נוגדנים במבחנה , עכברים מראש לחסן ויוו31. בניגוד שינויים גנטיים capsid, צימוד כימי של פולימרים מתבצע לאחר ייצור, טיהור, ומאפשר לא רק לשימוש של מפיק קונבנציונאלי תאים וייצור של מניות וקטור כייל נוגדנים גבוה, אלא גם עבור בו זמנית שינוי של אלפי חומצות אמינו על פני capsid. עם זאת, מכוון amine מיגון מתרחשת באופן אקראי לאורך כל השטח capsid כולו, וכתוצאה מכך heterogeneities גבוהה, לא מאפשר שינוי של capsomers ספציפיים. יתר על כן, moieties פולימר גדול הדרושים עבור השפעות מועילות לפגום וירוס אתריים32.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, Kreppel et al. 33 הציג תפיסה geneti-כימית עבור וקטור re – ואני מבטל את המיקוד. Cysteines שהוכנסו גנטית capsid וירוס החשופים הממס ומעמדות כמו סיבים HI-לולאה33, חלבון התשיעי34, קללה, זה35,36. אמנם יכול להיות מיוצר לא-טבעי, ציסטאין מניבי וקטורים Ad-titers גבוהה בתאים נורמליים הפקה. חשוב, החדרת cysteines capsomers מסוימים, עמדות שונות בתוך capsomer יחיד מאפשר שינויים ספציפי מאוד של תיול moieties קבוצה ראקטיבית. גישה geneti-כימית זו הוכח כדי להתגבר על מכשולים רבים בעיצוב וקטור לספירה. השילוב של מבוסס-אמין PEGylation detargeting, המבוסס על תיול זיווג transferrin על הידית סיבים ש-HI-לולאה הוכח כדי בהצלחה ייעד מחדש ששינה לספירה וקטורים חשוכת-הרכב התאים33. מאז קללה, זה מעורב אינטראקציות בלתי רצויה ביותר (נטרול נוגדנים, הגורם דם FX), המבוסס על תיול שינוי אסטרטגיות הוחלו גם על קללה, זה. צימוד moieties פג קטן כדי HVR5 של קללה, זה מנע חלקיקי וקטור לספירה מגלי SKOV-3 תאים בנוכחות FX, ואילו moieties פג גדול גדל hepatocyte-התמרה חושית-14,–35. המודעה וקטור חלקיקים נשיאת מוטציות בהידית סיבים עיכוב רכב מחייב וב -HVR7 מעכבים קשירה של FX (ו cysteines ברינג שנוספו ב- HVR1 עבור מיקום ספציפי PEGylation) הראו להם להתחמק נוגדן, המשלים-בתיווך ניטרול, כמו גם נבלות קולטן בתיווך ספיגת ללא הפסד של infectivity. מעניין, למרות חוסר המגן FX טבעי, PEGylation שוב שיפור התמרה חושית של hepatocytes כפונקציה של גודל פג36. עם זאת, זה הוצג כי מיגון קוולנטיות יש השפעה על תהליכים תאיים לסחר בבני אדם. Prill et al. לעומת בלתי הפיכות נגד bioresponsive מגינים על סמך pHPMA והפגינו כי גם את מצב תשלום מיגון ולא שותף פולימר הייתה השפעה על כניסת התא אך השפיעה חלקיקים סחר את הגרעין. העסקת מגן bioresponsive עם pHPMA הטעון חיובית פולימרים שיתוף המותר עבור חלקיקים סחר את הגרעין, שמירה על חיסכון התמרה חושית גבוהה של המודעה המומנט במבחנה , ויוו37.
לסיכום, נתונים אלה מציינים כי, אפילו תחת ההנחה כי כל וקטור-מארח-האינטראקציות היו ידועים ונחשבים, שינויים משטח capsid מופרז חיוניים להתגבר על המכשולים הקשורים עם משלוח וקטור מערכתית.
כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי לבצע שינויים כימיים בייעודי לאתר של capsids וקטור אדנו מיגון ו/או retargeting של חלקיקים וקטור אדנו ווירוסים oncolytic המבוסס על אדנו. הרעיון של טכנולוגיה זו מחולקת לרמות באיור1. היא מאפשרת מיגון של אזורים מסוימים capsid של אינטראקציות בלתי רצויות על ידי קוולנטיות מצורף של פולימרים סינתטיים. באותו, הוא גם מספק אמצעי כדי לצרף ליגנדים ולשלב הגנה ומיקוד. באמצעות כימיה פשוטה, ניסויים תהיה אפשרות לשינוי covalently משטח וקטור אדנו עם מגוון רחב של מולקולות כולל פפטידים/חלבונים, פחמימות, שומנים, ומולקולות קטנות אחרות. יתר על כן, הפרוטוקול מספק קונספט כללי שינוי כימי של וקטורים נגזר וירוס פעילים ביולוגית תחזוקה של שלמות הביולוגי שלהם פעילות.
היעילות שבה cysteines גנטית הציג יכול להיות מבחינה כימית שונה בדרך כלל 80-99%, משתנים מסוימים להשפיע על יעילות זו. קודם כל, זה בעל חשיבות עליונה כי cysteines גנטית הציג אינם עוברים חמצון מוקדמת. בעת היותו מוגן בסביבה תוך צמצום של התאים מפיק, זה חובה לספק סביבה שאינם חמצוני לאחר שחרור חלקיקים וקטור מתאי …
The authors have nothing to disclose.
Vector purification and chemical modification | |||
Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material for cell-culture | |||
DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material for silver staining protocol | |||
Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Special Lab Equipment | |||
Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
Megafuge 40 | Heraeus | ||
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
Water bath | Conventional | ||
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
pH -Meter | Conventional | ||
Stand with clamps | Conventional | ||
Goose neck lamp | Conventional | ||
Over-head rotor | Conventional | ||
Thermal Block | Conventional | ||
Photometer (OD 260) | Conventional |