Combinate le modifiche genetiche e chimiche del Capsid di vettori basati su Adenovirus Gene Transfer per schermatura e Targeting
Summary
Il protocollo descritto qui consente ai ricercatori di modificare specificamente capsidi adenovirus su siti selezionati dalla chimica semplice. Schermato adenovirus vettori particelle e gene bersagliamento trasferimento vettori possono essere generati, e interazioni ospite vettoriale possono essere studiati.
Abstract
L’adenovirus vettori sono potenti strumenti per Oncolitica di vaccinazione e oncolytic genetica. Tuttavia, sono inclini a più interazioni indesiderate vettore-ospite, soprattutto dopo la consegna in vivo . È un consenso che i limiti imposti dalle interazioni indesiderate vettore-ospite possono solo essere superata se vengono eseguite modifiche definite della superficie vettoriale. Tali modifiche includono targeting tramite l’introduzione di nuovi ligandi e schermatura delle particelle da interazioni indesiderate. L’obiettivo del protocollo presentato qui è quello di consentire al lettore di generare schermato e, se lo si desidera, reindirizzati adenovirus umano gene transfer vettori o virus oncolitici. Il protocollo consentirà ai ricercatori di modificare la superficie di capsidi vettoriale dell’adenovirus da allegato specifico chimica di polimeri sintetici, carboidrati, lipidi o altre molecole biologiche o chimiche. Esso descrive la tecnologia all’avanguardia di modifiche combinato del capsid genetica e chimica, che sono stati indicati per facilitare la comprensione e il superamento delle barriere per la consegna in vivo di vettori dell’adenovirus. Viene fornita una descrizione dettagliata e commentata delle fasi cruciali per l’esecuzione di specifiche reazioni chimiche con virus biologicamente attivi o vettori derivati dal virus. La tecnologia descritta nel protocollo si basa sull’introduzione genetica della cisteina (naturalmente assente) residui in solvente-esposti cicli di vettori derivati dell’adenovirus. Questi residui di cisteina forniscono una specifica reattività chimica che, dopo la produzione dei vettori per gli alti titoli, è utilizzabile per altamente specifico ed efficiente accoppiamento chimico covalente di molecole da una vasta gamma di classi di sostanze al vettore particelle. D’importanza, questo protocollo può essere facilmente adattato per eseguire un’ampia varietà di differenti modificazioni chimiche (non-tiolo-base) di capsidi vettoriale dell’adenovirus. Infine, è probabile che vettori di trasferimento non capsulati genica basati su virus diverso da quello dell’adenovirus può essere modificato dalla base del presente protocollo.
Introduction
Adenovirus (annuncio), membri della famiglia Adenoviridae, sono virus a DNA senza involucro di cui più di 70 tipi finora sono stati identificati (http://hadvwg.gmu.edu). Seconda hemaglutination proprietà, struttura del genoma e risultati di sequenziamento, i tipi di 70 annunci possono essere diviso in sette specie (Adenovirus umano A G)1,2. Il genoma umano di annuncio è di 38 kb e incapsulato da un nucleocapside icosahedral3. A causa della loro abbondanza, il hexon di proteina del capside, penton base e fibra sono tutti appresso proteine del capside principali. Il hexon di proteine più abbondanti e più grande capside forma 20 sfaccettature del capsid, ciascuno composto da 12 hexon homotrimers4,5. Penton, situato su ogni bordo icosahedral (vertice), si compone di pentameri di una base di penton e rappresenta la base per il picco di vertice che è costruito di glicosilata fibra trimeri5,6. La voce di cella Ad nativa è sostanzialmente composto da due fasi principali. In primo luogo, la manopola di fibra si lega al recettore primario. In tipi di annunci da specie A, C, E e F, questo è il recettore di coxsackie e adenovirus (auto). Questa interazione porta il virione in prossimità spaziale della superficie delle cellule, facilitando in tal modo le interazioni tra le integrine cellulare e RGD-motivo nel penton base e di conseguenza l’induzione delle risposte cellulari. In secondo luogo, cambiamenti nel citoscheletro conducono alla interiorizzazione del virione e trasporto alla endosoma7. Su smontaggio parziale nell’endosoma, il virione è rilasciato al citoplasma und viaggia in definitiva al nucleo per la replica.
Mentre l’annuncio possa essere recapitato localmente (ad es., per la vaccinazione genetica), sistemica consegna attraverso il flusso sanguigno come richiesto per onco-Oncolitica deve affrontare diversi ostacoli. Mentre circolano nella circolazione sanguigna, iniettati virioni ritrovarvi con il sistema di difesa del sistema immunitario dell’ospite, che porta alla rapida neutralizzazione dei vettori basati su virus e vettori basati su annuncio di rendering estremamente inefficiente in applicazioni sistemiche. Inoltre, la hepatotropism naturale dell’annuncio interferisce con la consegna sistematica e devono essere risolti per reindirizzare Ad a sue nuove cellule bersaglio.
Germinale-codificato gli anticorpi di IgM naturali del sistema immunitario innato rapidamente riconoscono e legano strutture altamente ripetitive sulla superficie del virione8,9. Questi complessi immuni quindi attivano le vie di classiche e non classica del sistema del complemento, che conduce velocemente complemento-mediata di neutralizzazione di una gran parte dei virioni8. Una seconda via conseguente rimozione principali dei virions di annuncio è mediata dai macrofagi10 e connessi con acuta tossica ed emodinamici effetti collaterali11,12. Nel caso di annuncio in particolare, Kupffer cellule residenti nel fegato associare a e phagocytically occupano l’annuncio virioni tramite specifici recettori scavenger, quindi eliminarli dal sangue13,14,15 . Recettori scavenger specifiche sono stati identificati anche su cellule endoteliali sinusoidali del fegato (cellule di LSE)16, e le cellule LSE sembrano anche contribuire al vettore eliminazione17, ma a che punto ha ancora bisogno di chiarimenti. Inoltre, alcuni tipi di annunci e dei loro vettori derivate in modo efficiente sono sequestrati da eritrociti umani18 a cui si legano tramite auto o il recettore del complemento CR119. Di nota, questo meccanismo sequestrante non può essere studiato nel sistema modello del mouse come in contrasto con gli eritrociti umani, gli eritrociti del mouse non esprimono auto.
Anticorpi specifici anti-annuncio generati dal sistema immunitario adattativo dopo l’esposizione a questo annuncio a causa di precedenti infezioni con l’annuncio o dopo la prima consegna in applicazioni sistemiche sollevare un ulteriore ostacolo all’efficace uso di vettori Ad, ed essi dovrebbero essere eluso in consegna efficiente e sistematica.
Infine, il forte hepatotropism di alcuni tipi di annunci (compresi Ad5) gravemente ostacola applicazione dell’annuncio in terapia sistemica. Questo tropismo conseguente trasduzione dell’epatocita è dovuto l’alta affinità del virione annuncio per il fattore di coagulazione di sangue X (FX), mediato dall’interazione di FX con l’annuncio del hexon proteina20,21,22. FX colma il virione di eparina solfato glicani (HSPGs) sulla superficie di epatociti20,23,24,25. Un fattore cruciale per questa interazione sembra essere la misura specifica di N – e O-solfatazione di HSPGs in cellule di fegato24, che è distinta da HSPGs su altri tipi di cellule. Oltre a questa via FX-mediata, gli studi recenti suggeriscono ulteriori percorsi non ancora identificati che si traducano in trasduzione di annuncio di epatociti26,27,28.
Recentemente, risulta che FX non è solo coinvolto nella trasduzione degli epatociti dell’annuncio, ma anche dall’associazione, il virione scudi la particella virale contro neutralizzazione dal sistema complemento26. Riduzione della trasduzione dell’epatocita impedendo l’associazione FX, pertanto, creerebbe l’effetto collaterale indesiderato di crescente annuncio neutralizzazione tramite il sistema immunitario innato.
Una profonda conoscenza delle complesse interazioni tra vettori e organismi ospite è quindi necessaria sviluppare vettori più efficiente per le applicazioni sistemiche che aggirare gli ostacoli imposti dall’organismo dell’ospite.
Una strategia che è stato originariamente utilizzata per le proteine terapeutiche è stata adattata per i vettori Ad almeno parzialmente superare le barriere descritte sopra. Antigenicità ed immunogenicità dei composti di proteine terapeutiche potrebbe essere ridotto dall’accoppiamento di polietilenglicole (PEG)29,30. Quindi, l’accoppiamento covalente di polimeri quali PEG o poli [N-(2-idrossipropil) methacrylamid] (pHPMA) per le proteine del capside superficie protegge il vettore da interazioni indesiderate vettore-ospite. Comunemente, polimero gruppi ε-amminici obiettivi di accoppiamento da residui di lisina laterali che sono distribuite in modo casuale sulla superficie del capside. Particelle di vettore in soluzione sono, a causa della natura idrofila dei polimeri allegati, circondate da un guscio di acqua stabile che riduce il rischio di riconoscimento delle cellule immuni o degradazione enzimatica. Inoltre, vettori di PEGylated annuncio sono stati indicati per eludere la neutralizzazione di anticorpi anti-hexon in vitro e in topi pre-immunizzati in vivo31. In contrasto con le modifiche genetiche del capsid, accoppiamento chimico dei polimeri viene eseguita dopo la produzione e purificazione, permettendo non solo per l’uso di convenzionale produttore cellule e produzione delle scorte di alto titolo vettoriale, ma anche per simultanea modifica di migliaia di aminoacidi sulla superficie del capside. Tuttavia, ammina-regia di schermatura si verifica in modo casuale su tutta la superficie intera del capsid, alta eterogeneità e non consentendo per la modifica di specifici capsomers. Inoltre, le moiety polimero grande necessarie per gli effetti benefici compromettere virus bioattività32.
Per superare queste limitazioni, Kreppel et al. 33 ha introdotto un concetto di geneti-chimiche per re – vettore e de-targeting. Cisteine geneticamente sono stati introdotti il capside del virus alle posizioni esposte al solvente come fibra HI-ciclo33, proteina IX34e hexon35,36. Anche se non naturale, cisteina-cuscinetto vettori di annuncio possono presentarsi ad alti titoli in cellule normali produttore. D’importanza, inserimento delle cisteine in determinate capsomers e in diverse posizioni all’interno di un singolo capsomer consente di effettuare modifiche altamente specifiche di moiety gruppo reattivo del tiolo. Questo approccio geneti-chimica ha dimostrato di superare numerosi ostacoli nel disegno vettoriale di annuncio. La combinazione di base ammina PEGilazione tiolo-basato di accoppiamento della transferrina alla manopola fibra che Hi-ciclo è stato provato con successo reimpostare per volta vettori di annuncio per auto-carenti cellule33e detargeting. Dal hexon è coinvolto nelle interazioni più indesiderati (neutralizzando gli anticorpi, FX di fattore di coagulazione del sangue), strategie di modificazione del tiolo-base vengono applicate anche ad hexon. Piccolo PEG moiety di accoppiamento a HVR5 del hexon ha impedito le particelle di vettore di annuncio per trasdurre cellule SKOV-3 in presenza di FX, mentre grande PEG moiety aumentato dell’epatocita trasduzione14,35. Particelle di vettore di annuncio che trasportano le mutazioni nella manopola fibra inibendo il legame auto e HVR7 legame d’inibizione della FX (e cuscinetto inserito cisteine in HVR1 per posizione-specifiche PEGilazione) sono state indicate per eludere la neutralizzazione degli anticorpi e complemento-mediata, così come assorbimento di mediata dal recettore scavenger senza perdita di infettività. È interessante notare che, malgrado una mancanza dello scudo naturale FX, PEGilazione nuovamente migliorato trasduzione degli epatociti in funzione della PEG dimensioni36. Tuttavia, è stato dimostrato che la schermatura covalente hanno un impatto sui processi di traffici intracellulari. Prill et al. rispetto irreversibile contro scudi bioresponsive basato su pHPMA e ha dimostrato che né la modalità di carica schermatura né co-polimero ha avuto un impatto su immissione di cella ma ha colpito la particella traffico al nucleo. Impiegando uno scudo bioresponsive con carica positiva pHPMA co-polimeri ammessi per traffico di particelle nel nucleo, mantenendo l’efficienza di trasduzione alta dell’annuncio vettori in vitro e in vivo37.
In sintesi, questi dati indicano che, anche sotto l’ipotesi che tutte le interazioni-ospite-vettore erano conosciute e considerate, capside eccessiva superficie sono necessarie modifiche per superare gli ostacoli connessi con consegna sistemica vettoriale.
Qui forniamo un protocollo per eseguire modifiche chimiche site-specifiche di capsidi vettoriale dell’adenovirus per schermatura e/o di retargeting di particelle di vettore dell’adenovirus e virus oncolitici basati sull’adenovirus. Il concetto di questa tecnologia è descritta nella Figura 1. Permette la schermatura di alcune regioni del capsid da interazioni indesiderate dal legame covalente di polimeri sintetici. Allo stesso tempo, fornisce anche un mezzo per collegare ligandi e combinare schermatura e targeting. Utilizzando chimica semplice, sperimentatori sarà in grado di modificare covalentemente superficie vettoriale dell’adenovirus con una grande varietà di molecole tra cui peptidi e proteine, carboidrati, lipidi e altre piccole molecole. Inoltre, il protocollo prevede un concetto generale per la modificazione chimica di vettori di virus-derivati biologicamente attivi sotto mantenimento della loro integrità biologica e attività.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’efficienza con cui le cisteine geneticamente introdotte possono essere modificate chimicamente è in genere 80-99%, e determinate variabili influenzano questa efficienza. In primo luogo, è fondamentale che le cisteine geneticamente introdotte non subiscono l’ossidazione prematura. Pur essendo ben protetto in ambiente riducente delle cellule del produttore, è obbligatorio fornire un ambiente non ossidativo dopo rilasciando particelle di vettore dalle cellule di produttore e durante la modificazione chimica. A tal fine…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
References
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, 570-573 (1953).
- van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
- Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
- Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
- Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
- Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
- Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
- Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
- Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
- Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
- Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
- Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
- Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
- Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
- Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
- Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
- Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
- Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
- Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
- Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
- Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
- Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
- Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
- O’Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
- Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
- Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
- Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
- Prill, J. -. M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
- Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. , 377-388 (2017).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).
