Combinação de modificações genéticas e químicas de capsídeos em vetores de transferência gênica baseados em adenovírus para blindagem e direcionamento
Summary
O protocolo descrito aqui permite que pesquisadores especificamente modificar capsids adenovírus em locais seleccionados pela química simples. Adenovírus blindado vectores partículas e vetores de transferência do gene redirecionada podem ser gerados, e interações do anfitrião de vetor podem ser estudadas.
Abstract
Vetores adenovírus são potentes ferramentas para virotherapy de vacinação e Oncolíticos genética. No entanto, eles são propensos a várias interações indesejáveis vetor-hospedeiro, especialmente após a entrega na vivo . É um consenso que as limitações impostas pela interação vetor-hospedeiro indesejado só podem ser superada se definidas modificações da superfície do vetor são executadas. Essas modificações incluem a blindagem das partículas de interações indesejadas e direcionamento pela introdução de novos ligantes. O objetivo do protocolo aqui apresentado é permitir que o leitor gerar protegido e, se desejado, redirecionados vetores de transferência de gene humano adenovírus ou vírus Oncolíticos. O protocolo permitirá que pesquisadores modificar a superfície do capsids do vetor de adenovírus pelo específico acessório químico de polímeros sintéticos, carboidratos, lipídios ou outras partes biológicas ou químicas. Descreve a tecnologia de ponta de modificações de capsídeo combinada de genética e química, que têm sido mostrados para facilitar a compreensão e superação das barreiras para entrega na vivo de vetores adenovírus. É fornecida uma descrição detalhada e comentada dos passos cruciais para a realização de reações químicas específicas com vírus biologicamente ativos ou vetores de vírus-derivado. A tecnologia descrita no protocolo baseia-se na introdução genética de cisteína (naturalmente ausente) resíduos em ciclos expostas ao solvente de vetores adenovírus-derivado. Estes resíduos de cisteína fornecem uma reatividade química específica que pode, após a produção dos vetores de altos títulos, ser explorada para altamente específico e eficiente acoplamento químico covalente de moléculas de uma grande variedade de classes de substância para o vetor partículas. Importante, este protocolo pode facilmente ser adaptado para executar uma ampla variedade de diferentes (não-tiol-baseado) as modificações químicas de capsids do vetor de adenovírus. Finalmente, é provável que esse vetores de transferência do gene de baseados em vírus não-envelopado além de adenovírus podem ser modificadas desde a base do presente protocolo.
Introduction
Adenovírus (Ad), membros da família Adenoviridae, são vírus de DNA não-envelope de que mais de 70 tipos até agora têm sido identificadas (http://hadvwg.gmu.edu). Dependendo hemaglutination Propriedades, estrutura do genoma e resultados de sequenciamento, os tipos de 70 Ad podem ser divididos em sete espécies (adenovírus humano À G)1,2. Genoma humano Ad é 38 kb em tamanho e encapsulado por um nucleocapsídeo icosahedral3. Devido à sua abundância, o hexon de proteínas do capsídeo, penton base e fibra são todos referidos como proteínas do capsídeo principais. O mais abundante e a maior hexon de proteínas do capsídeo forma 20 facetas do capsídeo, cada um composto por 12 hexon homotrimers4,5. Penton, localizado em cada borda icosaédrica (vértice), consiste em pentamers de uma base de penton e representa a base para o pico de vértice que é construído de glicosilados fibra trímeros5,6. A entrada da pilha nativa do Ad é composta basicamente de duas etapas principais. Primeiro, o botão de fibra liga-se ao receptor primário. Tipos de anúncio da espécie A, C, E e F, este é o receptor de coxsackie e adenovírus (carro). Essa interação traz o vírion em proximidade espacial da superfície celular, facilitando interações entre integrinas celulares e RGD-motif na penton base e consequentemente induzindo respostas celulares. Em segundo lugar, as alterações no citoesqueleto levam a internalização do virion e transporte para o endossomo7. Após desmontagem parcial no endossomo, o vírion é liberado para o citoplasma und, finalmente, viaja para o núcleo para replicação.
Enquanto Ad pode ser entregues localmente (ex., para a vacinação genética), entrega sistêmica através da corrente sanguínea conforme necessário para onco-virotherapy enfrenta várias barreiras. Ao circular na corrente sanguínea, injetados virions encontram o sistema de defesa da imunidade do hospedeiro, levando a rápida neutralização dos vectores baseados em vírus e renderização baseada em Ad-vetores extremamente ineficiente em aplicações sistêmicas. Além disso, o hepatotropism natural de Ad interfere com entrega sistêmica e deve ser resolvido para redirecionar Ad para suas novas células alvo.
Germline codificado IgM anticorpos naturais do sistema imunitário inato rapidamente reconhecem e vincular estruturas altamente repetitivas na superfície do virion8,9. Estes complexos imunes, em seguida, ativar as vias clássicas e não-clássica do sistema complemento, levando a neutralização rápido mediada por complemento de uma grande parcela do virions8. Um segundo caminho resultando em grande remoção de virions Ad é mediado por macrófagos10 e associado com aguda tóxico e hemodinâmicas efeitos colaterais11,12. No caso de anúncio em particular, Kupffer células que residem no fígado bind e phagocytically ocupam os Ad virions através ao tesouro específicos receptores, assim eliminando-os de sangue13,14,15 . Receptores específicos ao tesouro também foram identificados em células endoteliais sinusoidais fígado (células LSE)16, e células LSE também parecem contribuir para eliminação de vetor17, mas a que medida ainda precisa de esclarecimento. Além disso, alguns tipos de anúncio e seus vetores derivadas são eficientemente isolados por eritrócitos humanos18 a que se ligam através de carro ou o receptor do complemento CR119. Digno de nota, esse mecanismo de isolamento não pode ser estudado no sistema modelo de rato como em contraste com eritrócitos humanos, eritrócitos de rato não expressar o carro.
Anticorpos antianúncios específicos gerados pelo sistema imune adaptativo, após a exposição ao anúncio ou devido a infecções anteriores com Ad ou após a primeira entrega em aplicações sistêmicas levantem uma barreira mais eficaz utilização de vetores de Ad, e eles devem ser evitados em entrega eficiente e sistêmica.
Finalmente, o hepatotropism forte de alguns tipos de anúncio (incluindo Ad5) severamente dificulta a aplicação da Ad em terapia sistêmica. Este tropismo resultando na transdução de hepatócito é devido a alta afinidade do vírion a Ad de fator de coagulação de sangue X (FX), mediada pela interação de FX com a Ad hexon proteína20,21,22. FX pontes o vírion para os glicanos de sulfato de heparina (HSPGs) na superfície dos hepatócitos20,23,24,25. Um fator crucial para esta interação parece ser a medida específica de N – e O-sulfatação dos HSPGs em células do fígado,24, que é distinta da HSPGs em outros tipos de células. Além desta via mediada por FX, estudos recentes sugerem ainda mais vias ainda não identificaram que resultam na transdução de anúncio de hepatócitos26,,27,28.
Recentemente, ficou demonstrado que FX não é apenas envolvido na transdução de hepatócitos de Ad, mas também pela ligação, o vírion protege a partícula do vírus contra a neutralização pelo sistema de complemento26. Redução de transdução do hepatócito, impedindo a ligação de FX, portanto, criaria o efeito colateral indesejado de aumentar Ad neutralização através do sistema imunitário inato.
Um profundo conhecimento das complexas interações entre vetores e organismos host, portanto, é necessário desenvolver mais eficientes vetores para aplicações sistêmicas que contornar os obstáculos impostos pelo organismo do hospedeiro.
Uma estratégia que foi originalmente usada para proteínas terapêuticas foi adaptada para vetores de Ad para pelo menos parcialmente, ultrapassar as barreiras descritas acima. Antigenicidade e imunogenicidade de compostos de proteínas terapêuticas poderiam ser reduzidos pelo acoplamento com polietileno glicol (PEG)29,30. Daí, o acoplamento covalente de polímeros tais como PEG ou poli [N-(2-hidroxipropil) methacrylamid] (pHPMA) para o capsídeo superfície protege o vetor de interações indesejadas vetor-hospedeiro. Comumente, o acoplamento de polímero destinos grupos ε-amino dos resíduos de lisina lado aleatoriamente distribuídos na superfície do capsídeo. Partículas de vetor em solução são, devido à natureza hidrofílica dos polímeros anexados, rodeadas por uma concha de água estável que reduz o risco de reconhecimento imune celular ou degradação enzimática. Além disso, vetores peguilado Ad foram mostrados para iludir a neutralização por anti-hexon anticorpos em vitro e em camundongos previamente imunizado na vivo31. Em contraste com modificações genéticas capsídeo, acoplamento químico de polímeros é executado após a produção e purificação, permitindo não apenas para o uso de células de produtor convencional e produção das unidades populacionais de vetor de alta concentração, mas também para simultânea modificação de milhares de aminoácidos na superfície do capsídeo. No entanto, Amina-dirigido blindagem ocorre aleatoriamente em toda a superfície inteira do capsídeo, resultando em altas heterogeneidades e não permitindo a modificação de capsomers específico. Além disso, as metades de polímero grande exigidos para efeitos benéficos prejudicam vírus Bioatividade32.
Para superar essas limitações, Kreppel et al. 33 introduziu um conceito geneti-químicas para vetor re – e de orientação. Cisteínas introduzidas geneticamente o capsídeo do vírus em posições expostas ao solvente como fibra HI-laço33, proteína IX34e35,de hexon36. Embora não ocorrem naturalmente, cisteína-rolamento vetores Ad podem ser produzidos em títulos elevados em células normais do produtor. Importante, inserção de cisteínas em certas capsomers e em posições diferentes dentro de um único capsomer permite modificações altamente específicas de metades reativa-grupo tiol. Esta abordagem geneti-químicas foi mostrada para superar inúmeros obstáculos no design do vetor Ad. A combinação de baseado em amina PEGylation para acoplamento thiol-baseado da transferrina para o botão de fibra que Hi-laço tem sido comprovada com êxito redirecionar modificado vetores de anúncio de carro-deficiente células33e detargeting. Desde que o hexon está envolvido em interações mais indesejáveis (neutralizando anticorpos, fator de coagulação do sangue FX), estratégias de modificação thiol-baseado também foram aplicadas a hexon. Acoplamento de pequenas partes de PEG para HVR5 de hexon impediu partículas de vetor Ad para transduce SKOV-3 células na presença de FX, Considerando que grandes partes de PEG aumentaram hepatócito transdução14,35. Partículas de vetor de anúncio carregando mutações no botão de fibra, inibindo a ligação do carro e no HVR7 inibindo vinculação de FX (e cisteínas rolamento inserido em HVR1 para posição específica PEGylation) foram mostradas para iludir a neutralização mediada por anticorpos e complemento, assim como a captação de mediada ao tesouro sem perda de infecciosidade. Curiosamente, apesar da falta do escudo natural FX, PEGylation novamente melhorado transdução dos hepatócitos em função da PEG tamanho36. No entanto, foi demonstrado que a blindagem covalente tem um impacto sobre os processos de tráfico intracelulares. Prill et al. comparado irreversível contra escudos bioresponsive baseado no pHPMA e demonstrou que nem o modo de carga de blindagem nem co polímero teve um impacto na entrada da pilha, mas afetou a partícula tráfico para o núcleo. Empregar um escudo de bioresponsive com pHPMA carregados positivamente co polímeros permitidos para tráfico de partícula no núcleo, mantendo a eficiência elevada transdução de Ad vectores in vitro e in vivo37.
Em resumo, estes dados indicam que, mesmo sob a suposição de que todo vetor-hospedeiro-interações foram conhecidas e consideradas, modificações de superfície capsídeo excessiva são necessárias para superar os obstáculos associados com vetor sistêmica de entrega.
Aqui nós fornecemos um protocolo para realizar modificações químicas específicas de capsids do vetor de adenovírus para blindagem e/ou redirecionamento de partículas de vetor de adenovírus e vírus Oncolíticos baseados em adenovírus. O conceito desta tecnologia é descrito na Figura 1. Ele permite que a blindagem de certas regiões do capsídeo de interações indesejadas por ligação covalente de polímeros sintéticos. Ao mesmo tempo, ele também fornece um meio de anexar ligantes e combinam a blindagem e direcionamento. Usando simples química, experimentadores será capazes de modificar covalentemente a superfície de vetor adenovírus com uma grande variedade de moléculas incluindo peptídeos/proteínas, hidratos de carbono, lípidos e outras moléculas pequenas. Além disso, o protocolo prevê a modificação química de vetores de vírus-derivado biologicamente ativos sob a manutenção da sua integridade biológica e atividade a um conceito geral.
Protocol
Representative Results
Discussion
A eficiência, pelo qual as cisteínas geneticamente introduzidas podem ser quimicamente modificadas normalmente é 80-99%, e certas variáveis influenciam essa eficiência. Em primeiro lugar, é fundamental que as cisteínas geneticamente introduzidas não sofrem oxidação prematura. Apesar de ser bem protegida no ambiente de redução das células de produtor, é obrigatório para fornecer um ambiente não-oxidativo após liberar partículas de vetor de células o produtor e durante a modificação química. Para este…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
References
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