Kombineret genetiske og kemiske kapsid ændringer af Adenovirus-baserede genoverførsel vektorer for afskærmning og målretning
Summary
Protokollen beskrevet her gør det muligt for forskere at specifikt ændre adenovirus capsids på udvalgte steder ved simple kemi. Afskærmet adenovirus vektorer partikler og tilpassede gen overførsel vektorer kan genereres, og vektor værtssammenspil kan studeres.
Abstract
Adenovirus vektorerne er potent værktøj til genetiske vaccination og oncolytic virotherapy. Men de er udsat for flere uønskede vektor-værtssammenspil, især efter i vivo levering. Det er en enighed om, at de begrænsninger af uønskede vektor-værtssammenspil kan kun overvindes, hvis definerede ændringer af vektor overflade er udført. Disse ændringer omfatter afskærmning af partikler fra uønskede vekselvirkninger og målretning af indførelsen af nye ligander. Målet med protokollen præsenteres her er at give læseren til at generere afskærmet og, hvis det ønskes, tilpassede menneskelige adenovirus gen overførsel vektorer eller oncolytic virus. Protokollen vil sætte forskerne ændre overfladen af adenovirus vektor capsids af specifikke kemiske fastgørelse af syntetiske polymerer, kulhydrater, lipider, eller andre biologiske eller kemiske fraspaltning. Det beskriver den banebrydende teknologi af kombineret genetiske og kemiske kapsid ændringer, som har vist sig at lette forståelsen og overvindelse af hindringer for i vivo levering af adenovirus vektorer. En detaljeret og kommenteret beskrivelse af de afgørende skridt for at udføre specifikke kemiske reaktioner med biologisk aktive virus eller virus-afledte vektorer er fastsat. Den teknologi, der er beskrevet i protokollen er baseret på genetisk indførelsen af (naturligvis fraværende) cystein restkoncentrationer i opløsningsmiddel-eksponerede sløjfer af adenovirus-afledte vektorer. Disse cystein restkoncentrationer giver en bestemt kemisk reaktivitet, der kan, efter produktionen af vektorer til høj titers, udnyttes til meget konkrete og effektive kovalente kemiske kobling af molekyler fra et bredt udvalg af stof klasser at vektoren partikler. Vigtigere, kan denne protokol let tilpasses til at udføre en bred vifte af forskellige (ikke-thiol-baserede) kemiske modifikationer af adenovirus vektor capsids. Endelig er det sandsynligt at ikke-kappebærende virus-baseret gen overførsel vektorer end adenovirus kan ændres fra grundlaget for denne protokol.
Introduction
Adenovirus (Ad), medlemmer af familien Adenoviridae, er ikke-kappebærende DNA virus hvilke mere end 70 typer har hidtil været identificeret (http://hadvwg.gmu.edu). Afhængig af hemaglutination egenskaber, genom struktur og sekventering resultater, kan 70 annoncetyper opdeles i syv arter (menneskelige adenovirus A til G)1,2. Den menneskelige Ad genom er 38 kb i størrelse og indkapslet af en ikosaedriske nucleocapsid3. På grund af deres overflod, er kapsid proteiner hexon, penton base og fiber alle benævnt store kapsid proteiner. Den største og mest rigelige kapsid proteiner hexon udgør 20 kapsid facetter, hver bestående af 12 hexon homotrimers4,5. Penton, placeret på hver ikosaedriske kant (toppunkt), består af pentamers af en penton base og repræsenterer base for vertex spike, som er bygget af glykosyleret fiber trimere5,6. Den oprindelige annonce celleindtastning er dybest set består af to hovedtrin. Først, fiber knop binder sig til den primære receptor. I annoncetyper fra arter A, C, E og F er dette coxsackie og adenovirus receptoren (bil). Denne interaktion bringer virion i geografisk nærhed af cellens overflade, dermed at lette samspillet mellem cellulære integriner og M.H.T.-motiv i penton base og derfor overtalelse cellulære svar. For det andet ændringer i cytoskeleton fører til internalisering af virion og transport til endosome7. Efter delvis adskillelse i endosome, virion frigives til cytoplasma und i sidste ende rejser til kernen til replikering.
Mens annonce kan leveres lokalt (fx., for genetiske vaccination), systemisk levering gennem blodbanen som krævet for Kræftpsykologisk-virotherapy står over for flere barrierer. Samtidig cirkulerer i blodbanen, støder injiceres virioner forsvarssystem i værtens immunsystem, fører til hurtig neutralisering af de virus-baseret vektorer og rendering annonce-baseret vektorer ekstremt ineffektive i systemisk applikationer. Desuden, den naturlige hepatotropism annonce forstyrrer systemisk levering og skal løses til at omdirigere annonce til sin nye target-cellerne.
Genom-kodet naturlige IgM antistoffer af den medfødte immunsystem hurtigt genkende og binde hyppigt gentagne strukturer på overfladen af virion8,9. Disse immunkomplekser derefter aktivere den klassiske og ikke-klassisk veje af komplementsystemet, fører til hurtig komplement-medieret neutralisering af en stor del af virioner8. En anden vej, resulterer i større fjernelse af annonce virioner er medieret af makrofager10 og forbundet med akut toksisk og hæmodynamiske bivirkninger11,12. For Ad navnlig Kupffer celler i leveren binder til og phagocytically tage op Ad virioner via specifikke skyllevæske receptorer, således at fjerne dem fra blod13,14,15 . Specifikke skyllevæske receptorer er også blevet identificeret på leveren sinusformet endotelceller (LSE celler)16, og LSE celler også synes at bidrage til vektor eliminering17, men til hvilket omfang stadig behov for afklaring. Desuden, nogle annoncetyper og deres afledte vektorer er effektivt afsondret af menneskelige erytrocytter18 som de binder via bil eller supplere receptor CR119. Bemærk, dette kompleksdannere mekanisme kan studeres i mus modelsystem som i modsætning til menneskelige erytrocytter, mus erytrocytter udtryk ikke bil.
Specifikke anti-annonce antistoffer genereret af adaptive immunsystem efter udsættelse for annonce enten på grund af tidligere infektioner med annonce eller efter den første levering i systemisk programmer hæve en yderligere hindring for effektiv brug af Ad vektorer, og de bør omgås i effektiv systemisk levering.
Endelig, den stærke hepatotropism af nogle annoncetyper (herunder Ad5) alvorligt hindrer anvendelsen af annonce i systemisk terapi. Denne tropisme, hvilket resulterer i hepatocyt transduktion skyldes Ad virion høj affinitet til blod koagulationsfaktor X (FX), medieret af samspillet mellem FX med Ad hexon protein20,21,22. FX broer virion til heparin sulfat glycans (HSPGs) på overfladen af hepatocytter20,23,24,25. En afgørende faktor for denne interaktion synes at være det specifikke omfang af N – og O-sulfation af HSPGs i leverceller24, som er forskellig fra HSPGs på andre celletyper. Ud over denne FX-medieret vej tyder nylige undersøgelser på yderligere veje endnu ikke identificeret dette resultat i annonce transduktion af hepatocytter26,27,28.
For nylig, det har vist sig at FX ikke er kun involveret i hepatocyt transduktion af annonce, men også ved at binde sig, virion skjolde virus partikel mod neutralisering af komplement systemet26. Reduktion af hepatocyt transduktion ved at forhindre FX bindende, derfor ville skabe den uønskede bivirkning af stigende Ad neutralisering via det medfødte immunforsvar.
Et dybtgående kendskab til det komplekse samspil mellem vektorer og værtsorganismer er derfor nødvendigt at udvikle mere effektive vektorer for systemisk applikationer, at omgå hindringer pålagt af den værtsorganisme.
En strategi, der oprindeligt er brugt til terapeutiske proteiner er blevet tilpasset for annonce vektorer til i det mindste delvist løse de ovenfor beskrevne barrierer. Antigenicity og immunogenicitet af terapeutiske protein forbindelser kan reduceres ved at koble til polyethylenglycol (PEG)29,30. Derfor, den kovalente kobling af polymerer såsom PIND eller poly [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid] (pHPMA) til kapsid overflade skjolde vektoren fra uønskede vektor-værtssammenspil. Almindeligt, polymer kobling mål ε-amine grupper fra lysin side rester, der er tilfældigt fordelt på kapsid overflade. Vektor partikler i løsning er, på grund af hydrofile karakteren af de vedlagte polymerer, omgivet af en stabil vand shell, der reducerer risikoen for immun celle anerkendelse eller Enzymatisk nedbrydning. Derudover var pegyleret Ad vektorer vist at unddrage sig neutralisering af anti-hexon antistoffer i in vitro og i pre immuniserede mus i vivo31. I modsætning til genetiske kapsid ændringer, er kemiske kobling af polymerer udført efter produktion og rensning, tillader ikke blot brugen af konventionelle producent celler og produktion af høj titer vektor bestande, men også for samtidige ændring af tusindvis af aminosyrer på kapsid overflade. Dog opstår Amin-instrueret afskærmning tilfældigt i hele hele kapsid overflade, hvilket resulterer i høj heterogeneities og ikke giver mulighed for ændring af specifikke capsomers. Desuden, de store polymer fraspaltning kræves for gavnlige virkninger forringe virus bioactivity32.
At overvinde disse begrænsninger, Kreppel mfl. 33 indført en genetiskmodificeredeorganismer-kemisk begreb for vektor re- og de-målretning. Cysteines indført genetisk virus kapsid på opløsningsmiddel-udsatte positioner som fiber HI-loop33, protein IX34og hexon35,36. Selv om ikke naturligt forekommende, cystein-bærende Ad vektorer kan fremstilles på høj titers i normal producent celler. Vigtigere, indsættelse af cysteines i visse capsomers og i forskellige positioner inden for en enkelt capsomer giver mulighed for meget specifikke ændringer af thiol gruppe-reaktiv fraspaltning. Denne genetiskmodificeredeorganismer-kemiske tilgang har vist sig at overvinde mange forhindringer i annonce vektor design. Kombinationen af amin-baseret PEGylation til detargeting og thiol-baserede kobling af transferrin fiber knappen HI-loop er blevet bevist med held retarget modificeret Ad vektorer til bil-mangelfuld celler33. Da hexon er involveret i de mest uønskede vekselvirkninger (neutraliserende antistoffer, blod koagulationsfaktor FX), blev thiol-baserede ændring strategier også anvendt til hexon. Kobling lille PIND fraspaltning til HVR5 af hexon forhindret Ad vektor partikler til at transduce SKOV-3 celler i overværelse af FX, store PLØK fraspaltning steg hepatocyt transduktion14,35. Annonce vektor partikler bærer mutationer i fiber knop hæmme bil bindende og HVR7 hæmmende binding af FX (og forsynet med indsat cysteines i HVR1 for stilling-specifik PEGylation) var vist at unddrage sig antistof – og komplement-medieret neutralisering, samt skyllevæske receptor-medieret optagelse uden tab af smitteevne. Interessant nok, trods manglende naturlige FX skjoldet forbedret PEGylation igen transduktion af hepatocytter som en funktion af PIND størrelse36. Dog var det vist at kovalente afskærmning har en indvirkning på intracellulære menneskehandel processer. Prill mfl. sammenlignet med uoprettelige versus bioresponsive skjolde baseret på pHPMA og viste, at hverken tilstanden af afskærmning eller co-polymer afgift haft indvirkning på celleindtastning men påvirkede partikel handel til kernen. Ansætte en bioresponsive skjold med positivt ladede pHPMA Co polymere tilladt for partikel handel til kernen, opretholde de høje transduktion effektivitetsgevinster af annonce vektorer i in vitro og i vivo37.
I Resumé viser disse data, at selv under den antagelse, at alle vektor-værtssammenspil var kendt og anset, overdreven kapsid overflade ændringer er nødvendige for at overvinde de forhindringer, der er forbundet med systemisk vektor levering.
Her giver vi en protokol for at udføre lokationsspecifikke kemiske modifikationer af adenovirus vektor capsids for afskærmning og/eller retargeting adenovirus vektor partikler og adenovirus-baserede oncolytic virus. Begrebet denne teknologi er skitseret i figur 1. Det giver mulighed for afskærmning af visse kapsid regioner fra uønskede vekselvirkninger af kovalent fastgørelse af syntetiske polymerer. Samtidig giver det også et middel til at knytte ligander og kombinere afskærmning og målretning. Ved hjælp af simple kemi bliver eksperimentatorer kovalent redigere adenovirus vektor overflade med en bred vifte af molekyler herunder peptider/proteiner, kulhydrater, lipider og andre små molekyler. Derudover giver protokollen et generelt koncept for den kemiske modifikation af biologisk aktive virus-afledte vektorer under vedligeholdelse af deres biologiske integritet og aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den effektivitet, hvormed de genetisk indførte cysteines kan være kemisk modificeret er typisk 80-99%, og visse variabler påvirker effektiviteten. For det første er det afgørende, at de genetisk indførte cysteines ikke undergår for tidlig oxidation. Samtidig være godt beskyttet i den reducerende miljø af producent celler, er det obligatorisk at give en ikke-oxidative miljø efter at slippe vektor partikler fra producent celler og under kemisk modifikation. Med henblik herpå, reducere reagenser kan bruges i konc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
References
- Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).
- Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
- Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, 570-573 (1953).
- van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
- Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
- Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
- Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
- Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
- Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
- Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
- Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
- Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
- Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
- Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
- Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
- Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
- Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
- Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
- Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
- Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
- Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
- Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
- Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
- Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
- Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
- Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
- O’Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
- Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
- Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
- Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).
- Prill, J. -. M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
- Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
- Prill, J. -. M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
- Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. , 377-388 (2017).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).
