प्रोटोकॉल यहां वर्णित सक्षम बनाता है शोधकर्ताओं ने विशेष रूप से सरल रसायन विज्ञान द्वारा चयनित स्थलों पर एडीनोवायरस capsids संशोधित करने के लिए । परिरक्षण एडीनोवायरस वैक्टर कणों और retargetेड जीन स्थानांतरण वैक्टर उत्पंन किया जा सकता है, और वेक्टर मेजबान बातचीत का अध्ययन किया जा सकता है ।
एडीनोवायरस वैक्टर आनुवंशिक टीकाकरण और oncolytic virotherapy के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं । हालांकि, वे कई अवांछित वेक्टर-मेजबान बातचीत करने के लिए प्रवण हैं, विशेष रूप से vivo डिलीवरी में बाद । यह एक आम सहमति है कि अवांछित वेक्टर द्वारा लगाया सीमाओं-मेजबान बातचीत केवल अगर वेक्टर सतह के परिभाषित संशोधनों को दूर किया जा सकता है प्रदर्शन कर रहे हैं । इन संशोधनों अवांछित बातचीत से कणों की परिरक्षण और नए लाइगैंडों की शुरूआत के द्वारा लक्ष्यीकरण शामिल हैं । यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लक्ष्य पाठक को परिरक्षित उत्पन्न करने में सक्षम बनाना है और यदि वांछित हो तो पुनः लक्षित मानव एडीनोवायरस जीन अंतरण वैक्टर या oncolytic वायरस. प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं सिंथेटिक पॉलिमर, कार्बोहाइड्रेट, लिपिड, या अन्य जैविक या रासायनिक moieties के विशिष्ट रासायनिक लगाव द्वारा एडीनोवायरस वेक्टर capsids की सतह को संशोधित करने के लिए सक्षम हो जाएगा । यह संयुक्त आनुवंशिक और रासायनिक कैप्सिड संशोधनों की अत्याधुनिक प्रौद्योगिकी का वर्णन करता है, जो एडीनोवायरस वैक्टर के वितरण में बाधाओं के बारे में समझ और काबू पाने की सुविधा के लिए दिखाया गया है । एक विस्तृत और जैविक रूप से सक्रिय वायरस या वायरस व्युत्पंन वैक्टर के साथ विशिष्ट रासायनिक प्रतिक्रियाओं के प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण कदम का विवरण टिप्पणी प्रदान की जाती है । प्रौद्योगिकी प्रोटोकॉल में वर्णित (स्वाभाविक रूप से अनुपस्थित) विलायक में cysteine अवशेषों के आनुवंशिक परिचय पर आधारित है एडीनोवायरस-व्युत्पंन वैक्टर के छोरों उजागर । इन cysteine अवशेषों एक विशिष्ट रासायनिक जेट कि, उच्च titers के लिए वैक्टर के उत्पादन के बाद कर सकते हैं प्रदान करते हैं, अत्यधिक विशिष्ट और कुशल आबंध पदार्थ वर्गों की एक विस्तृत विविधता से अणुओं के सदिश के लिए रासायनिक युग्मन के लिए शोषण किया जा कणों. महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल को आसानी से विभिंन (गैर thiol आधारित) एडीनोवायरस वेक्टर capsids के रासायनिक संशोधनों के एक व्यापक विविधता प्रदर्शन अनुकूलित किया जा सकता है । अंत में, यह संभावना है कि गैर लिफाफा वायरस आधारित जीन हस्तांतरण एडीनोवायरस के अलावा अन्य वैक्टर इस प्रोटोकॉल के आधार से संशोधित किया जा सकता है.
एडिनोवायरस (Ad), परिवार Adenoviridae के सदस्यों, जिनमें से ७० से अधिक प्रकार अब तक पहचान की गई है (http://hadvwg.gmu.edu) गैर-ढंक डीएनए वायरस हैं । hemaglutination गुणों, जीनोम संरचना, और अनुक्रमण परिणाम के आधार पर, ७० विज्ञापन प्रकार सात प्रजातियों में विभाजित किया जा सकता है (मानव एडिनोवायरस A to G)1,2। मानव विज्ञापन जीनोम आकार में ३८ kb है और एक icosahedral nucleocapsid3द्वारा समझाया । उनके बहुतायत के कारण, कैप्सिड प्रोटीन hexon, penton बेस, और फाइबर सभी प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन के रूप में भेजा जाता है । सबसे प्रचुर मात्रा में और सबसे बड़ा कैप्सिड प्रोटीन hexon रूपों 20 कैप्सिड पहलुओं, प्रत्येक 12 hexon homotrimers4,5से मिलकर । Penton, प्रत्येक icosahedral एज (शिखर) पर स्थित है, एक Penton आधार के pentamers के होते है और शीर्ष स्पाइक है कि ग्लाइकोसिलेटेड फाइबर ट्रिमर5,6से बनाया गया है के लिए आधार का प्रतिनिधित्व करता है । मूल विज्ञापन सेल प्रविष्टि मूल रूप से दो प्रमुख चरणों से बना है । सबसे पहले, फाइबर घुंडी प्राथमिक रिसेप्टर को बांधता है. प्रजातियों में से विज्ञापन प्रकार में ए, सी, ई, और एफ, यह coxsackie और एडीनोवायरस रिसेप्टर (कार) है । इस बातचीत के सेल सतह के स्थानिक निकटता में विरिअन लाता है, जिससे सेलुलर integrins और RGD के बीच बातचीत की सुविधा penton आधार में आकृति और फलस्वरूप सेलुलर प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरण । दूसरा, cytoskeleton में परिवर्तन विरिअन के internalization के लिए सीसा और endosome7के लिए परिवहन । endosome में आंशिक विधानसभा पर, विरिअन कोशिका द्रव्य und अंततः प्रतिकृति के लिए नाभिक के लिए यात्रा करने के लिए जारी की है ।
जबकि विज्ञापन स्थानीय रूप से वितरित किया जा सकता है (जैसे, आनुवंशिक टीकाकरण के लिए), onco के लिए आवश्यक के रूप में खून के माध्यम से प्रणालीगत प्रसव-virotherapy कई बाधाओं का सामना । जबकि खून में घूम, इंजेक्शन virions है मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली की रक्षा प्रणाली मुठभेड़, वायरस के तेजी से बेअसर करने के लिए अग्रणी वैक्टर और विज्ञापन प्रतिपादन प्रणालीगत अनुप्रयोगों में अत्यंत अक्षम वैक्टर आधारित है । । । इसके अलावा, विज्ञापन की प्राकृतिक hepatotropism प्रणालीगत डिलीवरी में हस्तक्षेप करती है और विज्ञापन को उसके नए लक्ष्य कक्षों पर रीडायरेक्ट करने के लिए हल किया जाना चाहिए ।
सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के Germline इनकोडिंग प्राकृतिक आईजीएम एंटीबॉडी तेजी से पहचान और विरिअन8,9की सतह पर अत्यधिक दोहराव संरचनाओं बाँध । इन प्रतिरक्षा परिसरों तो शास्त्रीय और गैर शास्त्रीय मार्ग के पूरक प्रणाली को सक्रिय करने के लिए अग्रणी तेजी से पूरक-virions8के एक बड़े हिस्से की मध्यस्थता बेअसर । विज्ञापन virions के प्रमुख हटाने में जिसके परिणामस्वरूप एक दूसरा मार्ग मैक्रोफेज10 द्वारा मध्यस्थता और तीव्र विषाक्त और haemodynamic दुष्प्रभाव11,12के साथ जुड़ा हुआ है । विशेष रूप से विज्ञापन के मामले में, जिगर में रहने वाले Kupffer कोशिकाओं को बाइंड करने के लिए और phagocytically विशिष्ट मेहतर रिसेप्टर्स के माध्यम से विज्ञापन virions ले, जिससे उन्हें खून से नष्ट13,14,15 . विशिष्ट मेहतर रिसेप्टर्स भी जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं पर पहचान की गई है (एलएसई कोशिकाओं)16, और एलएसई कोशिकाओं को भी वेक्टर उंमूलन17में योगदान करने लगते हैं, लेकिन किस हद तक अभी भी स्पष्टीकरण की जरूरत है । इसके अलावा, कुछ विज्ञापन प्रकार और उनके व्युत्पंन वैक्टर कुशलतापूर्वक मानव एरिथ्रोसाइट्स18 जो वे कार या पूरक रिसेप्टर CR119के माध्यम से बांध द्वारा तनहा हैं । ध्यान रहे, इस sequestering तंत्र का अध्ययन माउस मॉडल सिस्टम में मानव एरिथ्रोसाइट्स के विपरीत नहीं किया जा सकता, माउस एरिथ्रोसाइट्स कार व्यक्त नहीं करते हैं ।
विज्ञापन के लिए जोखिम के बाद या तो विज्ञापन के साथ पिछले संक्रमण के लिए या प्रणालीगत अनुप्रयोगों में पहली डिलीवरी के बाद विज्ञापन वैक्टर के प्रभावी उपयोग के लिए एक और बाधा बढ़ाने के लिए निवेश के बाद अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा उत्पंन विशिष्ट विरोधी विज्ञापन एंटीबॉडी, और वे में चोरी हो जाना चाहिए कुशल प्रणालीगत वितरण ।
अंत में, कुछ विज्ञापन प्रकार के मजबूत hepatotropism (Ad5 सहित) गंभीर रूप से प्रणालीगत चिकित्सा में विज्ञापन के आवेदन में बाधा डालता है । hepatocyte transduction में जिसके परिणामस्वरूप यह tropism विज्ञापन hexon प्रोटीन20,21,22के साथ fx के संपर्क द्वारा मध्यस्थता रक्त जमावट कारक एक्स (fx) के लिए विरिअन के उच्च समानता के कारण है । FX हेपैटोसाइट्स20,23,24,25की सतह पर हेपरिन सल्फेट glycans (HSPGs) को विरिअन पुल । इस बातचीत के लिए एक महत्वपूर्ण कारक के लिए N की विशिष्ट सीमा और हे-sulfation जिगर की कोशिकाओं में HSPGs के24, जो अंय प्रकार के सेल पर HSPGs से अलग है लगता है । इस FX-मध्यस्थता मार्ग के अलावा, हाल के अध्ययनों से आगे अभी तक पहचान नहीं रास्ते का सुझाव है कि हेपैटोसाइट्स26,27,28के विज्ञापन transduction में परिणाम.
हाल ही में, यह दिखाया गया है कि FX केवल विज्ञापन के hepatocyte transduction में शामिल नहीं है, लेकिन यह भी बाध्यकारी द्वारा, विरिअन प्रणाली26पूरक द्वारा बेअसर के खिलाफ वायरस कण ढाल । hepatocyte transduction की कमी FX बंधन को रोकने के द्वारा, इसलिए, जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली के माध्यम से बढ़ती विज्ञापन बेअसर के अवांछित पक्ष प्रभाव पैदा होता है ।
वैक्टर और मेजबान जीवों के बीच जटिल बातचीत का एक गहरा ज्ञान इसलिए प्रणालीगत अनुप्रयोगों है कि मेजबान जीव द्वारा लगाया बाधाओं को दरकिनार के लिए और अधिक कुशल वैक्टर विकसित करने के लिए आवश्यक है ।
एक रणनीति है कि मूल रूप से चिकित्सकीय प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया गया है विज्ञापन वैक्टर के लिए अनुकूलित किया गया है कम से आंशिक रूप से ऊपर वर्णित बाधाओं को दूर । Antigenicity और चिकित्सकीय प्रोटीन यौगिकों के immunogenicity के लिए युग्मन से पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी)29,30कम किया जा सकता है । इसलिए, इस तरह के खूंटी या पाली के रूप में पॉलिमर के युग्मन आबंध [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid] (pHPMA) कैप्सिड सतह को ढाल वेक्टर अवांछित वेक्टर से मेजबान बातचीत । सामांयतः, बहुलक युग्मन लक्ष्य lysine पक्ष अवशेषों कि बेतरतीब ढंग से कैप्सिड सतह पर वितरित कर रहे है से ε-अमीन समूहों । समाधान में वेक्टर कणों, संलग्न पॉलिमर के हाइड्रोफिलिक प्रकृति के कारण, एक स्थिर पानी खोल कि प्रतिरक्षा कोशिका मान्यता या एंजाइमी क्षरण का खतरा कम कर देता है से घिरा हुआ है । इसके अलावा, PEGylated विज्ञापन वैक्टर विरोधी hexon एंटीबॉडी द्वारा बेअसर से बचने के लिए दिखाए गए इन विट्रो में और पूर्व में प्रतिरक्षित चूहों में vivo31. आनुवंशिक कैप्सिड संशोधनों के विपरीत, पॉलिमर के रासायनिक युग्मन उत्पादन और शोधन के बाद किया जाता है, न केवल पारंपरिक उत्पादक कोशिकाओं और उच्च titer वेक्टर शेयरों के उत्पादन के उपयोग के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक साथ के लिए कैप्सिड सतह पर अमीनो एसिड की हजारों की संशोधन । हालांकि, अमीन निर्देशित परिरक्षण पूरे कैप्सिड सतह भर में बेतरतीब ढंग से होता है, उच्च heterogeneities में जिसके परिणामस्वरूप और विशिष्ट capsomers के संशोधन के लिए अनुमति नहीं है. इसके अलावा, बड़े बहुलक moieties लाभकारी प्रभाव के लिए आवश्यक वायरस३२गतिविधि ख़राब ।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए Kreppel एट अल. ३३ वेक्टर पुनः के लिए एक geneti-रासायनिक अवधारणा और de-लक्ष्यीकरण पेश किया । Cysteines आनुवंशिक रूप से फाइबर हाय-पाश३३, प्रोटीन IX३४, और hexon३५,३६की तरह विलायक उजागर पदों पर वायरस कैप्सिड में पेश किया गया । हालांकि स्वाभाविक रूप से नहीं होने वाली, cysteine-असर विज्ञापन वैक्टर सामांय उत्पादक कोशिकाओं में उच्च titers में उत्पादन किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, कुछ capsomers में cysteines के सम्मिलन और एक एकल capsomer के भीतर विभिन्न स्थितियों में thiol समूह के अत्यधिक विशिष्ट संशोधनों के लिए अनुमति देता है-प्रतिक्रियाशील moieties. इस geneti-रासायनिक दृष्टिकोण विज्ञापन वेक्टर डिजाइन में कई बाधाओं को दूर करने के लिए दिखाया गया है । के संयोजन के लिए अमीन-आधारित PEGylation के निशान और thiol-आधारित युग्मन कैल्सीटोनिन के लिए फाइबर घुंडी उच्च पाश साबित किया गया है करने के लिए सफलतापूर्वक पुनः लक्षित संशोधित विज्ञापन वैक्टर कार की कमी कोशिकाओं को३३। चूंकि hexon सबसे अवांछित बातचीत में शामिल है (एंटीबॉडी बेअसर, रक्त जमावट कारक FX), thiol आधारित संशोधन रणनीतियों को भी hexon के लिए लागू किया गया । hexon के HVR5 के लिए युग्मन छोटे खूंटी moieties Ad वेक्टर कणों FX की उपस्थिति में SKOV-3 कोशिकाओं transduce करने के लिए रोका, जबकि बड़े खूंटी moieties बढ़ hepatocyte transduction14,३५. विज्ञापन वेक्टर कणों फाइबर घुंडी में उत्परिवर्तनों को लेकर कार बाध्यकारी बाधा और HVR7 में FX के बाध्यकारी बाधा (और स्थिति के लिए HVR1 में डाला cysteines असर-विशिष्ट PEGylation) एंटीबॉडी से बचने के लिए दिखाए गए थे-और पूरक-मध्यस्थता बेअसर, साथ ही मेहतर रिसेप्टर-मध्यस्थता infectivity की हानि के बिना ले । दिलचस्प है, प्राकृतिक FX ढाल की कमी के बावजूद, PEGylation फिर खूंटी आकार३६के एक समारोह के रूप में हेपैटोसाइट्स के transduction में सुधार हुआ । हालांकि, यह दिखाया गया है कि आबंध ढाल intracellular तस्करी प्रक्रियाओं पर असर पड़ता है । Prill एट अल. अपरिवर्तनीय बनाम pHPMA पर आधारित ढाल की तुलना में और प्रदर्शन किया है कि न तो ढाल और न ही सह बहुलक चार्ज के मोड सेल प्रविष्टि पर असर पड़ा था, लेकिन कण को प्रभावित नाभिक की तस्करी । सकारात्मक आरोप लगाया pHPMA सह के साथ एक प्रतिक्रियाशील ढाल को रोजगार कण के लिए कणों की तस्करी के लिए अनुमति दी पॉलिमर, इन विट्रो में और vivo३७में विज्ञापन वैक्टर के उच्च transduction क्षमता को बनाए रखने.
संक्षेप में, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि, यहां तक कि इस धारणा है कि सभी वेक्टर-मेजबान बातचीत जाना जाता था और माना जाता है के तहत, अत्यधिक कैप्सिड सतह संशोधनों के लिए प्रणालीगत वेक्टर डिलिवरी के साथ जुड़े बाधाओं को दूर करने के लिए आवश्यक हैं ।
यहां हम एडीनोवायरस वेक्टर capsids के परिरक्षण और/या एडीनोवायरस वेक्टर कणों और एडीनोवायरस-आधारित oncolytic वायरस के पुनर्लक्षितीकरण के लिए साइट-विशिष्ट रासायनिक संशोधनों को निष्पादित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस तकनीक की अवधारणा चित्रा 1में उल्लिखित है । यह सिंथेटिक पॉलिमर के आबंध लगाव द्वारा अवांछित बातचीत से कुछ कैप्सिड क्षेत्रों की परिरक्षण की अनुमति देता है । इसी के साथ, यह लाइगैंडों को संलग्न करने और परिरक्षण और लक्ष्यीकरण संयोजित करने का एक साधन भी प्रदान करता है. सरल रसायन विज्ञान का प्रयोग, प्रयोगकर्ता पेप्टाइड्स सहित अणुओं की एक विस्तृत विविधता के साथ एडीनोवायरस वेक्टर सतह को संशोधित करने में सक्षम हो जाएगा covalently/प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, लिपिड, और अन्य छोटे अणुओं. इसके अलावा, प्रोटोकॉल जैव सक्रिय वायरस के रासायनिक संशोधन के लिए एक सामांय अवधारणा प्रदान करता है, उनके जैविक अखंडता और गतिविधि के रखरखाव के अंतर्गत वैक्टर व्युत्पंन ।
दक्षता जिसके द्वारा आनुवंशिक रूप से शुरू cysteines रासायनिक संशोधित किया जा सकता है आमतौर पर 80-99% है, और कुछ चर इस क्षमता को प्रभावित । सबसे पहले, यह सर्वोपरि है कि आनुवंशिक रूप से शुरू cysteines समय से पहले ऑक्सीकरण स…
The authors have nothing to disclose.
Vector purification and chemical modification | |||
Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material for cell-culture | |||
DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material for silver staining protocol | |||
Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Special Lab Equipment | |||
Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
Megafuge 40 | Heraeus | ||
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
Water bath | Conventional | ||
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
pH -Meter | Conventional | ||
Stand with clamps | Conventional | ||
Goose neck lamp | Conventional | ||
Over-head rotor | Conventional | ||
Thermal Block | Conventional | ||
Photometer (OD 260) | Conventional |