Protokollet beskrivs här gör det möjligt för forskare att specifikt modifiera adenovirus förhoppningsvis på valda platser genom enkel kemi. Skärmad adenovirus vektorer partiklar och omriktade gen överföring vektorer kan genereras, och vector värd-interaktioner kan studeras.
Adenovirus vektorer är potent verktyg för genetiska vaccination och onkolytisk virotherapy. Men är de benägna att flera oönskade vektor-värd-interaktioner, särskilt efter i vivo leverans. Det är ett samförstånd att de begränsningar som oönskad vektor-värd-interaktioner kan bara övervinnas om definierade ändringar av vektor yta utförs. Dessa ändringar inkluderar avskärmning av partiklarna från oönskade interaktioner och inriktning genom införandet av nya ligander. Målet med det protokoll som presenteras här är att möjliggöra för läsaren att generera skärmade och, om så önskas, riktats mänskliga adenovirus gen överföring vektorer eller onkolytisk virus. Protokollet kommer att ge forskarna möjlighet att ändra ytan av adenovirus vektor förhoppningsvis genom specifika kemiska fastsättning av syntetiska polymerer, kolhydrater, lipider eller andra biologiska eller kemiska beståndsdelarna. Den beskriver den banbrytande tekniken kombinerad genetiska och kemiska kapsid ändringar, som har visat sig underlätta förståelsen och att övervinna hinder för i vivo leverans av adenovirus vektorer. En detaljerad och kommenterade Beskrivning av de avgörande stegen för att utföra specifika kemiska reaktioner med biologiskt aktiva virus eller virus-derived vektorer finns. Den teknik som beskrivs i protokollet är baserat på genetiska införandet av (naturligt frånvarande) cystein rester i lösningsmedel-exponerade slingor av adenovirus-derived vektorer. Dessa cystein rester ger en specifik kemisk reaktivitet kan, efter produktionen av vektorer till höga titrar, utnyttjas för mycket specifika och effektiva kovalent kemisk koppling för molekyler från ett brett utbud av ämnet klasser till vektorn partiklar. Allt kan detta protokoll enkelt anpassas för att utföra ett brett utbud av olika (icke-thiol-baserade) kemiska modifieringar av adenovirus vektor förhoppningsvis. Slutligen är det sannolikt de icke-höljebärande virus-baserat gen överföring vektorerna än adenovirus kan ändras från grunden för detta protokoll.
Adenoviruses (Ad), medlemmar av familjen Adenoviridae, är icke-höljebärande DNA virus av vilka mer än 70 typer har hittills identifierade (http://hadvwg.gmu.edu). Beroende på hemaglutination egenskaper, genomstruktur och sekvensering resultat, kan de 70 annonstyper delas in i sju arter (mänskliga adenoviruses A till G)1,2. Det mänskliga genomet Ad är 38 kb i storlek och inkapslat av en ikosaedrisk nucleocapsid3. På grund av sitt överflöd kallas den kapsid protein hexon, penton base och fiber alla stora kapsid proteiner. Den största och mest riklig kapsid protein hexon bildar 20 kapsid fasetter, vardera bestående av 12 hexon homotrimers4,5. Penton, varje ikosaedriska utkanten (vertex), består av pentamers av en penton bas och utgör en bas för vertex spike som är byggd av glykosylerat fiber trimerer5,6. Den infödda Ad cellinmatning består i princip av två stora steg. Först binder reglaget fiber till primära receptorn. I annonstyper från arter A, C, E och F är detta coxsackie och adenovirus receptorn (bil). Denna interaktion ger virion i rumslig närhet av cellens yta, vilket underlättar samspelet mellan cellulära integriner och RGD-motiv i penton bas och följaktligen inducerande cellulära svar. Andra förändringar i cytoskelettet leda till internalisering av virion och transport till endosome7. Vid partiell demontering i endosome, virion släpps till cytoplasman und slutligen reser till kärnan för replikering.
Medan Ad kan levereras lokalt (t.ex., för genetiska vaccination), systemisk leverans genom blodomloppet som krävs för onco-virotherapy står inför flera hinder. Samtidigt cirkulerar i blodet, stöta injicerade virioner försvaret av värdens immunsystem, vilket leder till snabb neutralisering av virus-baserat vektorer och rendering Ad-baserat vektorer extremt ineffektiv i systemisk applikationer. Dessutom de naturliga hepatotropism av Ad stör systemisk leverans och måste lösas för att omdirigera Ad till dess nya målceller.
Könsceller-kodade naturliga IgM antikroppar av det medfödda immunsystemet snabbt känner igen och binder mycket repetitiva strukturer på ytan av virion8,9. Dessa immunkomplex sedan aktiverar Komplementsystemet, leder till snabbt komplement-medierad neutralizationen av en stor del av virioner8klassisk och icke-klassisk promenadstråken. En andra väg som leder till större borttagning av Ad virioner är medierad av makrofager10 och associerade med akut giftigt och hemodynamiska biverkningar11,12. I fallet Ad särskilt eliminera Kupffers celler bosatt i levern binder till och phagocytically tar upp Ad virioner via specifika gatsopare receptorerna, därmed dem från blod13,14,15 . Specifika scavenger-receptorer har också identifierats på leverns sinusformig endotelceller (LSE celler)16och LSE celler verkar också bidra till vektor eliminering17, men till vilken utsträckning fortfarande behöver förtydligas. Dessutom är vissa annonstyper och deras härledda vektorer effektivt binds av humana erytrocyter18 de binder via bil eller komplement receptorn CR119. Notera denna binda mekanism inte kan studeras i mus modell systemet som i kontrast till humana erytrocyter, mus erytrocyter uttrycker inte bil.
Specifika anti-annonsen antikroppar genereras av det adaptiva immunsystemet efter exponering för Ad antingen på grund av tidigare infektioner med Ad eller efter den första leveransen i systemisk program höja ett ytterligare hinder för effektiv användning av Ad vektorer, och de bör kringgås i effektiv systemisk leverans.
Slutligen, den starka hepatotropism av vissa Ad typer (inklusive Ad5) allvarligt hindrar tillämpningen av Ad i systemisk terapi. Detta tropism som resulterar i hepatocyte transduktion beror på den Ad virion hög affinitet till blod koagulationsfaktor X (FX), medieras av samspelet mellan FX med Ad hexon protein20,21,22. FX överbryggar virion till heparin sulfat glycans (HSPGs) på ytan av hepatocyter20,23,24,25. En avgörande faktor för denna interaktion verkar vara specifika omfattningen av N – och O-sulfatering av HSPGs i leverceller24, som är skild från HSPGs på andra celltyper. Förutom denna FX-medierad väg föreslår nygjorda studier ytterligare vägar ännu inte identifierats som resulterar i Ad transduktion hepatocyter26,27,28.
Nyligen, det har visat att FX medverkar inte endast i hepatocyte transduktion AD, men också genom bindning, virion skyddar den virus-partikeln mot neutralisering av komplement system26. Minskning av hepatocyte transduktion genom att förhindra FX bindande, därför skulle skapa oönskade bieffekt av ökande Ad neutralisering via det medfödda immunsystemet.
Djupa kunskaper om de komplexa interaktioner mellan vektorer och värdorganismer är därför nödvändigt att utveckla mer effektiva vektorer för systemisk program att kringgå de hinder som införts av värdens organism.
En strategi som ursprungligen använts för terapeutiska proteiner har anpassats för Ad vektorer att åtminstone delvis lösa de ovan beskrivna hindren. Antigenicitet och immunogenicitet av terapeutiska proteinkomponenter kan minskas genom koppling till polyetylenglykol (PEG)29,30. Därav, kovalent kopplingen av polymerer, såsom PEG eller poly [N-(2-hydroxipropyl) methacrylamid] (pHPMA) att kapsid yta skyddar vektorn från oönskade vektor-värd-interaktioner. Vanligen, polymer koppling mål ε-Amin grupper från lysin sida restprodukter som fördelas slumpmässigt på kapsid ytan. Vector partiklar i lösning, hydrofil pågrund av de bifogade polymererna, omges av en stabil vatten skal som minskar risken för immunceller erkännande eller enzymatisk nedbrytning. Dessutom visades pegylerat Ad vektorer att kringgå neutralisering av anti-hexon antikroppar i vitro och i förväg immuniserade mössen i vivo31. Till skillnad från genetiska kapsid modifieringar utförs kemiska kopplingen av polymerer efter produktion och rening, så att inte bara för användning av konventionella producent celler och produktionen av hög titer vektor bestånd, men också för samtidiga ändring av tusentals aminosyror på kapsid ytan. Men uppstår amine-riktad avskärmning slumpmässigt i hela hela kapsid ytan, vilket resulterar i höga heterogeneitiesna och inte tillåter ändring av specifika capsomers. Dessutom försämra de stor polymer delarna krävs för positiva effekter virus bioaktivitet32.
Att övervinna dessa begränsningar, Kreppel et al. 33 infört ett Arbetsmiljöverket-kemiska begrepp för vektor re- och de inriktning. Cysteines infördes genetiskt i virus kapsid på lösningsmedel-utsatta positioner som fiber HI-loop33, protein IX34och hexon35,36. Även om inte naturligt, cystein räntebärande Ad vektorer kan produceras på höga titrar i normala producent celler. Ännu viktigare, möjliggör införande av cysteines i vissa capsomers och i olika positioner inom en enda capsomer mycket specifika ändringar av tiol grupp-reaktivt beståndsdelarna. Detta Arbetsmiljöverket-kemiska tillvägagångssätt har visat att övervinna många hinder i Ad vektor design. Kombinationen av amine-baserade pegylering för detargeting och thiol-baserade koppling av transferrin åt fiber vredet HI-loop har bevisats att framgångsrikt nytt mål den Ad vektorer till bil-brist celler33. Eftersom hexon är inblandad i mest oönskade interaktioner (neutraliserande antikroppar, blod koagulationsfaktor FX), tillämpades thiol-baserade modifiering strategier även på hexon. Koppling små PEG beståndsdelarna till HVR5 av hexon förhindras Ad vektor partiklar för att transduce SKOV-3 celler i närvaro av FX, medan stora PEG beståndsdelarna ökade hepatocyte transduktion14,35. AD vektor partiklar bär mutationer i fiber vredet hämma bil bindning och HVR7 hämmande bindningen av FX (och uthärda införas cysteines i HVR1 för position-specifika pegylering) visades att kringgå antikropp – och komplement-medierad neutralisering, liksom scavenger receptor-medierad upptag utan förlust av smittsamhet. Intressant, trots bristen på naturliga FX sköld förbättrade pegylering igen transduktion av hepatocyter som en funktion av PEG storlek36. Emellertid var det visat att kovalent skärmning har en inverkan på intracellulära människohandel processer. Prill et al. jämfört med irreversibla kontra bioresponsive sköldar utifrån pHPMA och visat att varken funktionsläget av avskärmning eller kopolymer kostnad inverkade på cellinmatning men påverkade partikel människohandel till kärnan. Anställa en bioresponsive sköld med positivt laddade pHPMA sampolymerer tillåtet för partikel människohandel till kärnan, att upprätthålla de höga transduktion effektivitetsvinsterna av Ad vektorer in vitro- och in-vivo37.
Sammanfattningsvis visar dessa data att, även under antagandet att alla vektor-värd-interaktioner var känd och ansedd, överdriven kapsid ytmodifieringar är nödvändigt att övervinna de hinder som är associerad med systemisk vektor leverans.
Här tillhandahåller vi ett protokoll för att utföra platsspecifik kemiska modifieringar av adenovirus vektor förhoppningsvis för avskärmning eller retargeting av adenovirus-baserade onkolytisk virus och adenovirus vektor partiklar. Begreppet denna teknik beskrivs i figur 1. Det gör att strålskyddet av vissa kapsid regioner från oönskade interaktioner genom kovalent fastsättning av syntetiska polymerer. Samtidigt ger det också en möjlighet att bifoga ligander och kombinera skärmning och inriktning. Med hjälp av enkel kemi, kommer praktiker att kunna kovalent modifiera adenovirus vektor yta med en mängd olika molekyler inklusive peptider/proteiner, kolhydrater, lipider och andra små molekyler. Protokollet ger dessutom ett allmänt begrepp för kemisk modifiering av biologiskt aktiva virus-derived vektorer under underhåll av deras biologiska integriteten och aktivitet.
Effektivitet genom vilken de genetiskt introducerade cysteines kan vara kemiskt modifierade är typiskt 80-99%, och vissa variabler påverkar denna effektivitet. Det första är det avgörande att de genetiskt introducerade cysteines inte genomgår tidig oxidering. Samtidigt vara väl skyddade i reducerande miljö av producenten cellerna, är det obligatoriskt att tillhandahålla en icke-oxidativ miljö efter att ha släppt vektor partiklar från producenten celler och under kemisk modifiering. I detta syfte att minska r…
The authors have nothing to disclose.
Vector purification and chemical modification | |||
Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material for cell-culture | |||
DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material for silver staining protocol | |||
Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Special Lab Equipment | |||
Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
Megafuge 40 | Heraeus | ||
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
Water bath | Conventional | ||
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
pH -Meter | Conventional | ||
Stand with clamps | Conventional | ||
Goose neck lamp | Conventional | ||
Over-head rotor | Conventional | ||
Thermal Block | Conventional | ||
Photometer (OD 260) | Conventional |