细胞外通量分析技术在视网膜组织外种中的能量代谢测定
Summary
该技术描述了使用细胞外助焊剂分析仪实时记录小鼠视网膜组织的耗氧量和细胞外酸化率。
Abstract
高敏锐度视觉是一个消耗大量能源的过程, 视网膜已经开发了几个独特的适应, 以精确地满足这些需求, 同时保持视觉轴的透明度。这种微妙平衡的扰动会导致致盲疾病, 如糖尿病视网膜病变。因此, 了解疾病期间视网膜能量代谢的变化, 对于开发合理的治疗各种原因的粘滞丢失至关重要。最近出现的商业细胞外通量分析仪使视网膜能量代谢的研究更容易获得。该协议描述了使用这种分析仪来测量通过其两个主要武器-氧化磷酸化和糖酵解-通过量化氧气消耗率 (ocr) 和细胞外的变化对视网膜能量供应的贡献酸化率 (ecar) 作为这些途径的代理。这项技术很容易在视网膜组织的移植中进行, 有助于在一个实验中评估对多种药理制剂的反应。利用该方法将缺乏棒光感受器信号的动物视网膜的代谢特征与野生型对照进行了比较。这项技术的一个主要局限性是缺乏区分光适应和暗适应能量利用的能力, 这是视网膜组织中的一个重要的生理考虑因素。
Introduction
视网膜是中枢神经系统中能量要求最高的组织之一 1.与大多数组织一样, 它通过细胞溶胶中的糖酵解或线粒体中的氧化磷酸化生成三磷酸腺苷 (atp)。氧化磷酸化比糖酵解产生 atp 的高能优势是显而易见的:36 分子的 atp 产生的前者与2分子产生的 atp产生后者。因此, 视网膜神经元主要依靠线粒体呼吸来获得能量供应, 这反映在它们的高密度线粒体2上。然而, 即使氧气丰富, 视网膜也严重依赖糖酵解机械。奥托尔·沃堡3号最初在癌细胞中描述了这种有氧糖酵解的过程, 他曾经指出, 视网膜是唯一能够产生这种代谢形式的有丝分裂后组织.自从这些初步观察, 许多有丝分裂后的组织已被描述为从事不同程度的糖酵解, 除了氧化磷酸化, 以满足他们的 atp 需求。
光转导、视觉色素回收、光感受器外段的生物合成和突触活动都是光感受器中的能量要求过程, 是视网膜中的主要神经元亚类。但在神经元1中, 积极地根据其电梯度和浓度梯度运输离子的需要是迄今为止最有活力的消耗过程。光感受器是一种特殊的神经元, 因为它们在没有刺激的情况下 (即在黑暗中) 会去极化, 而光刺激会触发通道闭合和随后的超极化。因此, 在黑暗中, 视网膜消耗大量的 atp 来维持其去极化或通常所说的 “暗流”。从适应性的角度来看, 提供大量 atp 的一个主要挑战是生物体需要通过光轴保持视觉清晰度。在现代生物中看到的倒置视网膜结构是主要的解决方案, 因为它使密集的毛细管网络远离光的路径提供光感受器。但这种自然生物工程的奇迹使视网膜在代谢储备方面处于悬崖状态。即使是对视网膜的小侮辱, 也有可能破坏能源供应与需求的微妙平衡, 视觉功能障碍或坦率失明可能会很快接踵而至。
鉴于神经视网膜独特的能量需求, 再加上其对血管供应的严格限制, 准确测量视网膜中 atp 的消耗及其在疾病期间的变化可能对理解和治疗产生深远的影响。致盲疾病, 如视网膜色素变性和糖尿病视网膜病变。传统上, 这些测量需要昂贵的、定制设计的设备, 大多数研究来自于少数完全致力于测量代谢活动2,5, 6、 7,8。技术包括针对特定代谢物的单独检测、使用无线电标记前体的示踪剂研究、使用克拉克电极的耗氧量记录以及代谢组学特征分析 9。
随着高通量技术的进步和商业设备供应的增加, 记录视网膜代谢的技术越来越容易获得, 而且价格也越来越实惠。这里描述的方法测量氧化磷酸化和糖酵解在视网膜使用解释组织和一个商业上可用的细胞外通量分析仪9,10,11, 12.该分析仪单独记录耗氧率 (ocr) 和细胞外酸化率 (ecar), 分别作为氧化磷酸化和糖酵解的间接指标 13.这些测量是通过一个埋在所关注组织上的微腔内的探针完成的。这种对先前公布的方法的调整使用了最初为朗格汉胰岛设计的捕获板, 记录小鼠视网膜小的圆形部分的代谢活动。由于该系统包含每个样品井的4个注射端口, 因此在一次记录过程中, 可以将多种药物暴露传递给组织。使用该系统与单独的协议优化 ecar 和 ocr 记录, 野生类型视网膜的反应可以比较视网膜缺乏传感器(gnat1-/–), 一个先天性固定夜盲症的原因人类14.
Protocol
Representative Results
Discussion
ocr 和 ecar 很容易测量在解释视网膜组织使用生物分析仪使用所述的技术。此方法在几个关键步骤中与其他组的方法不同。视网膜组织是通过一个大的角膜切口分离而不是在地球上摘除的, 正如温克勒15 最初所描述的那样。这种视网膜隔离方法允许从活眼快速转移到组织捕捉板 (通常在5分钟内)。在整个过程中, 组织保持在 37°c, 比放在冰上时更好地保持细胞呼吸。使用最少添加剂?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢亚历山大·科列斯尼科夫博士和弗拉基米尔·凯法洛夫博士提供了 gnat1-/mics,提供了有益的反馈和建议, 并阅读了手稿。
这项工作得到了 nih ey025269 (rr)、华盛顿大学糖尿病研究中心-nih dk020579 (jrm 和 rr)、预防失明研究职业发展奖、霍恩克雷斯特基金会 (rr)、jdrf 职业发展奖 (jrm)、nih dk101392 (cfs)、dk020579 (cfs)、dk056341 (cfs) 和 dk114233 (jrm)。
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
