Mesure du métabolisme énergétique chez Explanté tissu rétinien en utilisant l’analyse de Flux extracellulaire
Summary
Cette technique décrit enregistrement en temps réel de la consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire dans les tissus rétiniens explantés souris à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire.
Abstract
Vision de l’acuité élevée est un processus fortement consommateurs d’énergie, et la rétine a développé plusieurs adaptations uniques pour répondre précisément à ces exigences tout en conservant la transparence de l’axe visuel. Perturbations à cet équilibre délicat causent des maladies aveuglantes, telles que la rétinopathie diabétique. Par conséquent, la compréhension des changements de métabolisme énergétique de la rétine au cours de la maladie est impérative pour le développement de thérapies rationnelles pour diverses causes de perte de vison. L’avènement récent des analyseurs de flux extracellulaire disponible dans le commerce a fait l’étude du métabolisme énergétique rétinien plus accessible. Ce protocole décrit l’utilisation d’un tel analyseur pour mesurer la contribution à l’approvisionnement énergétique rétinien par l’intermédiaire de ses bras deux principe – la phosphorylation oxydative et la glycolyse – en quantifiant les changements dans les taux de consommation d’oxygène (OCR) et extracellulaire taux d’acidification (ECAR) comme proxy pour ces voies. Cette technique est facilement réalisée dans le tissu rétinien explanté, facilitant l’évaluation des réponses à plusieurs agents pharmacologiques dans une expérience simple. Métaboliques signatures dans la rétine des animaux dépourvus de signalisation de photorécepteur tige sont comparés aux contrôles de type sauvage à l’aide de cette méthode. Une limitation majeure de cette technique est le manque de capacité d’établir une distinction entre l’utilisation de l’énergie lumière adaptés et adapté à l’obscurité, un facteur physiologique important dans le tissu rétinien.
Introduction
La rétine est parmi les plus énergivores tissus dans le système nerveux central1. Comme la plupart des tissus, il génère l’adénosine triphosphate (ATP) via la glycolyse dans le cytosol ou via la phosphorylation oxydative dans les mitochondries. L’avantage énergétique de la phosphorylation oxydative au cours de la glycolyse pour produire de l’ATP d’une molécule de glucose est clair : 36 molécules d’ATP générées par l’ancien vs 2 molécules d’ATP générée à partir de ce dernier. En conséquence, les neurones rétiniens dépendent principalement de la respiration mitochondriale pour l’approvisionnement en énergie et cela se reflète par leur forte densité des mitochondries,2. Pourtant, la rétine aussi repose largement sur machines glycolytique même lorsque l’oxygène est abondante. Ce processus de glycolyse aérobie a été initialement décrite dans les cellules cancéreuses par Otto Warburg3, qui une fois a noté que la rétine est le seul post-mitotique tissu capable de cette forme de métabolisme4. Depuis ces premières observations, plusieurs tissus post-mitotiques ont été décrites pour se livrer à des degrés divers de la glycolyse en plus de la phosphorylation oxydative à répondre à leurs demandes d’ATP.
Phototransduction, pigment visuel recyclage, biosynthèse des segments externes des photorécepteurs et l’activité synaptique sont tous les processus exigeants de l’énergie dans les photorécepteurs, la sous-classe neuronale prédominante dans la rétine. Mais la nécessité de transporter activement des ions contre leur électriques et des gradients de concentration est de loin le plus énergiquement de votre processus en neurones1. Photorécepteurs sont des neurones particulières en ce sens qu’ils sont dépolarisés en l’absence de stimulation (c’est-à-dire, dans l’obscurité), alors qu’un stimulus lumineux déclenche la fermeture du chenal et l’Hyperpolarisation ultérieure. Par conséquent, dans l’obscurité, la rétine consomme de grandes quantités d’ATP pour maintenir sa dépolarisation ou « courant d’obscurité » comme on l’appelle communément. D’un point de vue adaptatif, un défi majeur dans la fourniture de ces énormes quantités d’ATP est la nécessité pour les organismes à maintenir une clarté visuelle par le biais de l’axe optique. L’architecture rétinienne inversé vu dans créatures modernes est la solution dominante, car il maintient le réseau capillaire dense fournissant des photorécepteurs de la voie de la lumière. Mais cette merveille du génie biologique naturel met la rétine à bord d’un précipice en termes de réserve métabolique. Même les petites insultes à la rétine peuvent potentiellement perturber l’équilibre délicat de l’approvisionnement énergétique de la demande, et la dysfonction visuelle ou cécité franche peut s’ensuivre rapidement.
Étant donné l’unique avec les besoins énergétiques de la rétine neuronale, couplée à sa restriction serrée d’approvisionnement vasculaire, une mesure précise de la consommation d’ATP dans la rétine et ses changements au cours de la maladie pourrait avoir de profondes implications dans la compréhension et le traitement aveuglante d’affections comme la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique. Traditionnellement, ces mesures nécessitent des équipements coûteux, conçus avec la plupart des études qui sortent d’une poignée de laboratoires entièrement dédié aux mesures de l’activité métabolique2,5,6, 7,8. Les techniques comprennent des essais individuels pour les métabolites spécifiques, études par traceurs utilisant les précurseurs marqués radio, consommation d’oxygène d’enregistrement à l’aide d’électrodes de Clark et métabolomique profilage9.
Grâce aux progrès des technologies de haut débit et une disponibilité accrue des appareils commerciaux, techniques au métabolisme rétinien record sont toujours plus accessible et abordable. La méthode décrite ici permet de mesurer tant la phosphorylation oxydative et la glycolyse dans l’utilisation de la rétine explantées tissus et un flux extracellulaire disponible dans le commerce analyseur9,10,11,12. Cet analyseur enregistre séparément les taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR), servant d’indicateurs indirects de la phosphorylation oxydative et de la glycolyse, respectivement13. Ces mesures sont effectuées par une sonde immergée dans un microchamber créé sur le tissu d’intérêt. Cette adaptation de méthodes publiées antérieurement utilise une plaque de capture initialement conçue pour le pancréas, îlots de Langerhans pour enregistrer l’activité métabolique en petites sections circulaires de rétine de souris. Des expositions pharmacologiques multiples peuvent être livrées au tissu au cours d’un enregistrement unique, car le système contient 4 ports d’injection pour chaque échantillon bien. Grâce à ce système avec des protocoles distincts optimisés pour les enregistrements ECAR et OCR, les réponses des rétines sauvage peuvent être comparés aux rétines manque tbl1xr1 (Gnat1– / –), des causes de cécité nocturne stationnaire congénitale en les humains14.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCR et ECAR sont facilement mesurable en tissu rétinien explanté, à l’aide d’un bioanalyzer en utilisant les techniques décrites. Cette méthode diffère de celles des autres groupes en plusieurs étapes cruciales. Les tissus rétiniens sont isolées à travers une large incision cornéenne sans enucleating du globe, qui avaient été initialement décrit par Winkler,15. Cette méthode d’isolement rétinienne permet un transfert rapid de le œil de la vie dans la plaque de capture de tis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Alexander Kolesnikov et Dr Vladimir Kefalov pour fournir des Gnat1– / –souris, de conseil et d’informations utiles et pour la lecture du manuscrit.
Ce travail a été soutenu par NIH EY025269 (RR), le centre de recherche du diabète à l’Université de Washington – NIH DK020579 (JRM et RR), un Career Development Award de la recherche pour prévenir la cécité (RR), la Fondation Horncrest (RR), une bourse de développement de carrière du (de la FRDJ JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) et DK114233 (JRM).
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
References
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