Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular
Summary
Esta técnica descreve a gravação em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular nos tecidos da retina explantados rato, usando um analisador de fluxo extracelular.
Abstract
Visão de alta acuidade é um processo altamente consumidores de energia, e a retina desenvolveu várias adaptações exclusivas para atender precisamente tais demandas, mantendo a transparência do eixo visual. Perturbações para este delicado equilíbrio causam doenças cegantes, como retinopatia diabética. Portanto, a compreensão das mudanças do metabolismo de energia na retina durante a doença é fundamental para o desenvolvimento de terapias racionais para várias causas de perda de visão. O recente advento dos analisadores de fluxo extracelular comercialmente disponíveis tornou mais acessível o estudo do metabolismo energético da retina. Este protocolo descreve o uso de um analisador de medir as contribuições para o fornecimento de energia da retina através de seus braços dois princípio – fosforilação oxidativa e glicólise – através da quantificação de alterações em taxas de consumo de oxigênio (OCR) e extracelular taxas de acidificação (ECAR) como proxies para essas vias. Esta técnica é executada prontamente no tecido da retina explantado, facilitando a avaliação das respostas a vários agentes farmacológicos em uma única experiência. Assinaturas metabólicas em retinas de animais sem haste fotorreceptoras sinalização são comparadas aos controles do selvagem-tipo usando esse método. Uma limitação importante nesta técnica é a falta de capacidade de discernir entre a utilização de energia de luz-adaptado e vez, uma importante consideração fisiológica no tecido da retina.
Introduction
A retina é entre os tecidos mais exigentes de energia no sistema nervoso central1. Como a maioria dos tecidos, gera triphosphate de adenosina (ATP) via glicólise no citosol ou via fosforilação oxidativa em mitocôndrias. A vantagem energética da fosforilação oxidativa sobre glicólise para produzir ATP a partir de uma molécula de glicose é clara: 36 moléculas de ATP gerado a partir do antigo vs 2 moléculas de ATP gerado deste último. Por conseguinte, os neurônios da retina dependem principalmente de respiração mitocondrial para fornecimento de energia e isto é refletido por sua alta densidade de mitocôndrias2. Ainda, a retina também confia pesadamente na maquinaria glicolítico mesmo quando o oxigênio é abundante. Este processo de glicólise aeróbica foi originalmente descrito em células cancerosas por Otto Warburg3, que uma vez observou que a retina foi o tecido apenas pós mitótico capaz desta forma de metabolismo4. Desde essas observações iniciais, muitos tecidos pós mitóticos têm sido descritos para se envolver em vários graus de glicólise além de fosforilação oxidativa para atender suas demandas de ATP.
Fototransdução, pigmentos visuais, reciclagem, biossíntese de segmentos exteriores fotoreceptor e atividade sináptica são todos os processos exigentes de energia nos fotorreceptores, a subclasse neuronal predominante na retina. Mas a necessidade de transportar ativamente íons contra seus eléctricos e gradientes de concentração é de longe o processo que consumia muito mais energicamente em neurônios1. Fotorreceptores são neurônios peculiares no sentido de que eles são despolarizados na ausência de estimulação (ou seja, no escuro), Considerando que um estímulo de luz aciona o fechamento do canal e hiperpolarização subsequente. Portanto, no escuro, a retina consome grandes quantidades de ATP para manter sua despolarização ou “corrente escura”, como é comumente chamado. Do ponto de vista adaptativa, um grande desafio no fornecimento destes grandes quantidades de ATP é a necessidade dos organismos manter a clareza visual através do eixo óptico. A arquitetura da retina invertida vista em modernas criaturas é a solução dominante, como mantém a densa rede capilar fornecendo fotorreceptores longe o caminho da luz. Mas esta maravilha de bioengenharia natural coloca a retina em um precipício em termos de reserva metabólica. Mesmo pequenos insultos à retina potencialmente podem perturbar o delicado equilíbrio da oferta e a procura de energia, e disfunção visual ou cegueira franca possam decorrer rapidamente.
Dada a demanda energética única da retina neural, juntamente com sua restrição apertada de suprimento vascular, medição precisa do consumo de ATP, a retina e suas mudanças durante a doença pode ter profundas implicações na compreensão e tratamento cegando condições tais como a retinite pigmentosa e retinopatia diabética. Tradicionalmente, estas medidas exigem equipamentos caros, personalizados com a maioria dos estudos emergentes de um punhado de laboratórios inteiramente dedicado às medições da atividade metabólica2,5,6, 7,8. As técnicas incluem ensaios individuais para metabolitos específicos, estudos de rastreamento usando precursores rotulado de rádio, gravação usando eletrodos de Clark e metabolómica9de criação de perfil de consumo de oxigênio.
Com os avanços na tecnologia de alta produtividade e aumento da disponibilidade de dispositivos comerciais, técnicas de registro metabolismo da retina são cada vez mais acessível e disponível. O método descrito aqui mede ambos fosforilação oxidativa e glicólise na retina usando explantados tecido e um analisador do fluxo extracelular comercialmente disponíveis9,10,11,12. Este analisador separadamente registra taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação do extracelular (ECAR), servindo como indicadores indirectos de fosforilação oxidativa e glicólise, respectivamente13. Essas medições são feitas por uma sonda submergida dentro de um microchamber criado sobre o tecido de interesse. Esta adaptação dos métodos publicados anteriormente usa uma placa de captura, projetada originalmente para pâncreas ilhotas de Langerhans para gravar a atividade metabólica em seções pequenas, circulares da retina do rato. Várias exposições farmacológicas podem ser entregues para o tecido no decurso de uma única gravação, porque o sistema contém 4 portas de injeção para cada amostra bem. Usando este sistema com protocolos separados, otimizados para gravações ECAR e OCR, respostas do selvagem-tipo retina podem ser comparadas com as retinas falta transducina (Gnat1– / –), uma causa de cegueira congênita de noite estacionária em os seres humanos14.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCR e ECAR prontamente são medidos em explantados tecido retinal usando um bioanalyzer usando as técnicas descritas. Este método parte das de outros grupos em várias etapas críticas. Tecidos da retina são isolados por meio de uma grande incisão da córnea sem enucleating do globo, como foi originalmente descrito por Winkler15. Este método de isolamento da retina permite uma rápida transferência do olho vivo para a placa de captura de tecido (muitas vezes dentro de 5 minutos). Os tecidos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. Alexander Kolesnikov e Dr. Vladimir Kefalov para fornecer Gnat1– / –ratos, para comentários úteis e conselhos e para ler o manuscrito.
Este trabalho foi financiado pelo NIH EY025269 (RR), o Diabetes Research Center na Universidade de Washington – NIH DK020579 (JRM e RR), um prêmio de desenvolvimento de carreira de investigação para evitar cegueira (RR), a Fundação Horncrest (RR), um prêmio de desenvolvimento de carreira de (JDRF JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) e DK114233 (JRM).
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
References
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