Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular
Summary
Esta técnica describe la grabación en tiempo real del consumo de oxígeno y los tipos de acidificación extracelular en los tejidos retinianos explanted ratón utilizando un analizador de flujo extracelular.
Abstract
Alta agudeza de la visión es un proceso altamente consumidor de energía, y la retina ha desarrollado varias adaptaciones únicas para precisamente cubrir tales demandas manteniendo la transparencia del eje visual. Las perturbaciones a este delicado equilibrio causan enfermedades cegadoras, tales como la retinopatía diabética. Por lo tanto, la comprensión de los cambios de metabolismo de energía en la retina durante la enfermedad es imprescindible para el desarrollo de tratamientos racionales para diversas causas de pérdida de visión. La reciente llegada de los analizadores de flujo extracelular comercialmente disponible ha realizado el estudio del metabolismo energético retiniana más accesible. Este protocolo describe el uso de tal un analizador para medir las contribuciones al suministro de energía retiniana a través de sus brazos dos principio – fosforilación oxidativa y glucólisis – mediante la cuantificación de cambios en las tasas de consumo de oxígeno (OCR) y extracelular tipos de acidificación (ECAR) como proxies para estas vías. Esta técnica se realiza fácilmente en el tejido retiniano explanted, facilitar la evaluación de las respuestas a múltiples agentes farmacológicos en un solo experimento. Firma metabólica en las retinas de los animales que carecen de señalización de fotorreceptores de varilla se comparan con controles de tipo salvaje con este método. Una limitación importante en esta técnica es la falta de capacidad de discriminar entre la utilización de la energía luz-adaptado y oscuro-adaptado, una consideración fisiológica importante en el tejido retiniano.
Introduction
La retina es el tejido más demanda de energía en el sistema nervioso central1. Como la mayoría de los tejidos, genera trifosfato de adenosina (ATP) mediante la glucólisis en el citosol o a través de fosforilación oxidativa en las mitocondrias. La ventaja energética de la fosforilación oxidativa en la glucólisis para producir ATP a partir de una molécula de glucosa es clara: 36 moléculas de ATP generan por ex vs 2 moléculas de ATP que se generan a partir de este último. En consecuencia, las neuronas retinianas principalmente dependen de la respiración mitocondrial para suministro de energía y esto se refleja en su alta densidad de mitocondrias2. Sin embargo, la retina también depende en gran medida maquinaria glicolítica incluso cuando el oxígeno es abundante. Este proceso de glucólisis aeróbica fue descrito originalmente en las células cancerosas por Otto Warburg3, quien una vez observó que la retina el tejido sólo poste-mitotic capaces de esta forma de metabolismo4. Desde las observaciones iniciales, se han descrito muchos tejidos poste-mitotic para participar en diversos grados de glucólisis además de fosforilación oxidativa para atender sus demandas de ATP.
Fototransducción, pigmento visual reciclaje, biosíntesis de los segmentos externos del fotorreceptor y actividad sináptica son todos procesos exigentes de energía en los fotorreceptores, la subclase neuronal predominante en la retina. Pero la necesidad de transportar activamente los iones contra su eléctrico y gradientes de concentración es en gran medida el proceso energéticamente más lento en las neuronas1. Fotorreceptores son neuronas peculiar en el sentido que ellos son despolarizados en ausencia de estímulo (es decir, en la oscuridad), mientras que un ligero estímulo provoca cierre de canal y subsecuente hiperpolarización. Por lo tanto, en la oscuridad, la retina consume grandes cantidades de ATP para mantener su despolarización o “corriente oscura” como comúnmente se le llama. Desde un punto de vista adaptativo, un desafío importante en el suministro de estas grandes cantidades de ATP es la necesidad de los organismos mantener la claridad visual a través del eje óptico. La arquitectura retiniana invertida en criaturas modernas es la solución dominante, ya que mantiene la densa red capilar suministro de fotorreceptores lejos el camino de la luz. Pero esta maravilla de la bioingeniería natural coloca a la retina en un precipicio en términos de reserva metabólica. Incluso los pequeños insultos a retina potencialmente pueden perturbar el delicado equilibrio de la oferta de energía a la demanda, y la disfunción visual o ceguera Franco puede sobrevenir rápidamente.
Dadas las demandas energéticas únicas de la retina neural, junto con su restricción apretado de la fuente vascular, una medición precisa del consumo de ATP en la retina y sus cambios durante la enfermedad podría tener profundas implicaciones en la comprensión y el tratamiento de cegamiento de condiciones tales como retinitis pigmentosa y la retinopatía diabética. Tradicionalmente, estas medidas requieren equipo costoso, diseñado con la mayoría de los estudios de un puñado de laboratorios enteramente dedicado a las mediciones de la actividad metabólica2,5,6, 7,8. Las técnicas incluyen ensayos individuales de metabolitos específicos, estudios tracer usando precursores marcados con radio, grabación usando electrodos de Clark y metabolómicos perfiles9el consumo de oxígeno.
Con los avances en la tecnología de alto rendimiento y mayor disponibilidad de dispositivos comerciales, técnicas de registro del metabolismo retiniano son cada vez más accesibles y asequibles. El método descrito aquí mide tanto la fosforilación oxidativa y glicolisis en retina utilizando explantados tejido y un analizador de flujo extracelular comercialmente disponibles9,10,11,12. Este analizador por separado registra tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR), sirviendo como indicadores indirectos de la fosforilación oxidativa y la glicolisis, respectivamente13. Estas mediciones son realizadas por una sonda sumergida dentro de una microcámara en el tejido de interés. Esta adaptación de los métodos previamente publicados utiliza una placa de captura diseñada originalmente para los islotes pancreáticos de Langerhans para grabar la actividad metabólica en secciones pequeñas, circulares de retina de ratón. Múltiples exposiciones farmacológicas pueden entregarse al tejido durante el curso de una sola grabación porque el sistema contiene 4 puertos de inyección para cada muestra bien. Utilizando este sistema con protocolos aparte optimizados para grabaciones de ECAR y OCR, las respuestas de tipo salvaje retinas se pueden comparar con retinas carentes transducina (Gnat1– / –), una causa de ceguera de noche inmóvil congénita en los seres humanos14.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCR y ECAR se miden fácilmente en el tejido retiniano explanted utilizando un equipo bioanalyzer utilizando las técnicas descritas. Este método parte de los de otros grupos en varios pasos críticos. Los tejidos retinianos son aislados a través de una incisión corneal grande sin enucleando el mundo, originalmente descrito por Winkler15. Este método de aislamiento retiniana permite una transferencia rápida del ojo en la placa de captura de tejido (a menudo dentro de 5 minutos). Los tejidos s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Alexander Kolesnikov y Dr. Vladimir Kefalov para proporcionar Gnat1– / –ratones, información útil y consejos y por leer el manuscrito.
Este trabajo fue financiado por los NIH EY025269 (RR), el centro de investigación de la Diabetes en la Universidad de Washington – NIH DK020579 (JRM y RR), un premio de desarrollo de carrera de la investigación para evitar la ceguera (RR), la Fundación Horncrest (RR), un premio de desarrollo de carrera de JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CSA), DK020579 (CSA), DK056341 (SFC) y DK114233 (JRM).
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
References
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