細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定
Summary
この手法では、酸素消費量と細胞外酸性化率 explanted マウス網膜組織細胞フラックス アナライザーを使用してリアルタイムの記録について説明します。
Abstract
高視力ビジョンが大きくエネルギー消費のプロセス、網膜が正確に視軸の透明性を維持しながらこのような要求を満たすためにいくつかのユニークな適応を開発しました。この微妙なバランスに摂動は、まばゆいばかりの病気、糖尿病網膜症などを引き起こします。したがって、病気中に網膜におけるエネルギー代謝の変化の理解は、ビジョンの損失の様々 な原因のための合理的な治療法の開発することが不可欠です。市販の細胞フラックス アナライザーの最近の出現より使いやすい網膜のエネルギー代謝の研究をしました。このプロトコルを記述するこのような酸素消費量 (OCR) の変化を定量化することでその 2 つの主要武器 – 酸化的リン酸化と解糖系 – を通じて網膜のエネルギー供給への貢献を測定する分析装置の使用および細胞外これらの経路のプロキシとして酸性化率 (ecar と)。この手法は、explanted 網膜組織、単一の実験で複数の薬理学的薬剤への応答の評価を促進することで容易に実行されます。棒の光受容器シグナリングに欠けている動物から網膜に代謝の署名は、このメソッドを使用して野生型コントロールと比較されます。このテクニックでの主な制限は、明順応と低エネルギー利用、網膜組織の重要な生理学的な考察を区別する能力の欠如です。
Introduction
網膜は中枢神経系に1で最もエネルギー要求の厳しい組織です。同じようなほとんどの組織は、ミトコンドリアの細胞質または経由で酸化的リン酸化で解糖系によってアデノシン三リン酸 (ATP) を生成します。1 分子のグルコースから ATP を生成する解糖作用上の酸化的リン酸化のエネルギッシュな利点は明らか: 36 分子の ATP 生成から、前者と後者から生成される ATP の 2 分子。したがって、網膜神経細胞は主にエネルギーをミトコンドリア呼吸に依存して、これはミトコンドリア2の密度が高いで反映されます。しかし、網膜もに大きく依存して解糖系機械酸素が豊富な場合も。好気性解糖系のこのプロセスは、オットーウォーバーグ3、かつて指摘した網膜のみ分裂組織代謝4のこの形のことができる人によってがん細胞で最初に説明だった。これらの初期の観測以来多くの分裂組織を酸化的リン酸化に加え解糖作用の度合いでその ATP の要求を満たすために従事するのに記載されています。
光伝導、視覚顔料リサイクル、視細胞外側セグメントとシナプスの活性の生合成は、光受容体、網膜で優勢な神経細胞のサブクラス内のすべてのエネルギー要求の厳しいプロセスです。積極的に彼らの電気に対するイオンと濃度勾配を輸送する必要がニューロン1で最も精力的にかかる。光受容体は、(すなわち、暗闇の中で)、刺激のない状態で脱分極が光刺激トリガー チャンネル閉鎖とその後過分極に対し意味で特異な神経細胞です。したがって、網膜は、暗闇の中は一般的に呼ばれるように、その脱分極や「暗電流」を維持するために ATP の大量を消費します。適応の観点からは、これら大量の ATP を供給の主要課題は、光軸を通して映像の明瞭さを維持するために有機体のための必要性です。モダンな生き物に見られる倒立網膜建築光のパスから視細胞を供給密な毛細血管網を保持して支配的な解決策であります。この自然なバイオ エンジニア リングの驚異は代謝の準備の面で絶壁で網膜を配置します。網膜に小さくても侮辱に需要へのエネルギー供給の微妙なバランスが中断される可能性が、視覚障害や失明のフランクはすぐに起こることがあります。
血管供給のタイトな制限と相まって、神経網膜のユニークなエネルギッシュな要求を与え病気中に網膜とその変化で ATP 消費量の正確な測定の理解と治療に大きな影響を与えますが網膜色素変性症、糖尿病網膜症などの失明状態。伝統的に、これらの測定は研究所代謝活性2,5,6、測定専用の握りから新たな研究のほとんどと、特注の高価な機器を必要とします。 7,8。技術は、特定の代謝物、標識前駆体、クラーク電極とメタボローム9のプロファイリングを使用して録音の酸素消費量を用いたトレーサー研究個々 の試金を含んでいます。
ハイスループット技術および商業のデバイスの可用性の向上が進み、レコード レチナール代謝する技術はますます入手しやすく現実的。ここで説明したメソッドが両方酸化的リン酸化を測定し、網膜を使用して解糖系仔組織と市販の細胞フラックス アナライザー9,10、11,12。このアナライザーは、酸素消費量 (OCR) と酸化的リン酸化と解糖系、それぞれ13の間接的な指標として細胞の酸性化率 (ecar と)、別々 に記録します。これらの測定は、水没して興味の組織に作成されたマイクロチャンバ内プローブによって行われます。以前に発行されたメソッドのこの適応では、膵ランゲルハンス島用に設計されたキャプチャ プレートを使用マウス網膜の小さい、円形のセクションで代謝活性を記録します。複数の薬理学的なエクスポー ジャーは、システムも各サンプルの 4 つの注入ポートが含まれるために、単一の記録の中に、組織に配信できます。Ecar と OCR の録音のために最適化された別のプロトコルでこのシステムを使用して、野生型網膜の反応 (Gnat1-/-)、トランスデューシン欠けている網膜と比較することで先天性定常夜盲症の原因人間14。
Protocol
Representative Results
Discussion
OCR と ecar とは、記載された方法を使用してバイオアナライザーを用いた explanted 網膜組織に容易に測定します。このメソッドは、いくつかの重要なステップの他のグループのそれらから出発します。網膜組織はウィンクラー15によって最初に記述されている、世界中を enucleating することがなく大規模な角膜切開に分離されます。網膜の分離のこの方法は、組織キャプチャ板?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gnat1-/-を提供する、博士アレクサンダー Kolesnikov と博士ウラジミール ・ Kefalov に感謝マウス、有益なフィードバックとアドバイス、および、原稿を読んでします。
この作品は NIH EY025269 (RR)、ワシントン大学 – NIH DK020579 糖尿病研究センターによってサポートされていた (JRM と RR) を防ぐため失明 (RR)、Horncrest 財団 (RR)、JDRF (からキャリア開発賞の研究から、キャリア ・ デベロップメント賞JRM)、NIH DK101392 (CFS)、DK020579 (CFS)、DK056341 (CFS)、DK114233 (JRM)。
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
References
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