Måling av energi Metabolism i Explanted netthinnen vev ekstracellulære Flux analyse
Summary
Denne teknikken beskriver sanntid opptak av oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser i explanted musen netthinnens vev bruker en ekstracellulære flux analyserer.
Abstract
Høy skarphet visjon er en tungt energikrevende prosess netthinnen har utviklet flere unike tilpasninger for å møte nettopp slike krav samtidig gjennomsiktighet på den visuelle aksen. Forstyrrelser til denne delikate balanse føre blendende sykdommer, som diabetisk retinopati. Forståelsen av energi metabolism endringer i netthinnen under sykdom er derfor viktig å utvikling av rasjonell terapi for ulike årsaker til Vision tap. Det nylige advent kommersielt tilgjengelig ekstracellulære flux analyserer har gjort studiet av netthinnen energi metabolism mer tilgjengelig. Denne protokollen beskriver bruken av slike en analyserer å måle bidrag til netthinnen energiforsyning gjennom sine to prinsippet armer – oxidative fosforylering og Glykolysen – ved å kvantifisere endringer i oksygen forbruk priser (OCR) og ekstracellulære forsuring priser (ECAR) som proxyer for disse veiene. Denne teknikken er lett utført i explanted netthinnen vev, tilrettelegge vurdering av Svar å flere farmakologisk agenter i ett enkelt eksperiment. Metabolsk signaturer i Netthinne fra dyr mangler rod photoreceptor signalering er sammenlignet med vill-type kontroller bruker denne metoden. En stor begrensning i denne teknikken er mangel på evne til å skille mellom lys-tilpasset og dark-adapted energi utnyttelse, en viktig fysiologiske faktor i netthinnen vev.
Introduction
Netthinnen er blant de mest energikrevende vev i sentralnervesystemet1. Som de fleste vev genererer den adenosin trifosfat (ATP) via Glykolysen i stoffer eller via oxidative fosforylering i mitokondrier. Energisk fordelen av oxidative fosforylering over Glykolysen å produsere ATP fra ett molekyl av glukose er klart: 36 molekyler av ATP generert fra den tidligere vs 2 molekyler av ATP generert fra sistnevnte. Følgelig retinal neurons avhengig primært av mitokondrie åndedrett for energiforsyning og dette gjenspeiles ved deres høy tetthet av mitokondrier2. Likevel, netthinnen også avhengig av tungt glycolytic maskiner selv når oksygen er rikelig. Denne prosessen med aerobic Glykolysen ble opprinnelig beskrevet i kreftceller av Otto Warburg3, som en gang bemerket at netthinnen var bare etter mitotisk vevet kan denne formen for metabolisme4. Siden de første observasjonene, er mange etter mitotisk vev beskrevet å engasjere seg i varierende grad av Glykolysen i tillegg oxidative fosforylering å møte sine ATP krav.
Phototransduction, visual pigment gjenvinning, biosyntesen photoreceptor ytre segmenter og synaptic aktivitet er alle energi krevende prosesser i fotoreseptorer, dominerende neuronal underklassen i netthinnen. Men behovet for å transportere aktivt ioner mot deres elektriske og konsentrasjon graderinger er desidert mest energisk tidkrevende prosessen i neurons1. Fotoreseptorer er særegne nerveceller i den forstand at de er depolarized i fravær av stimulering (dvs. i mørket), mens en lys stimulans utløser kanal nedleggelse og påfølgende hyperpolarization. Derfor, i mørket, netthinnen forbruker store mengder ATP å opprettholde sin depolarization eller “mørke gjeldende” som det kalles. Fra en adaptiv ståsted er en stor utfordring i å levere disse enorme mengder ATP behovet for organismer å opprettholde visuell klarhet gjennom den optiske aksen. Invertert retinal arkitektur i moderne skapninger er den dominerende løsningen, som den holder tett capillary nettverket leverer fotoreseptorer fra stien av lys. Men dette vidunder av naturlige bioteknologi steder netthinnen på et stup i metabolske reserve. Selv små fornærmelser netthinnen kan potensielt forstyrre den fine balansen i energiforsyning behov, og visuelle dysfunksjon eller frank blindhet kan følge raskt.
Gitt de unike energisk kravene av neural netthinnen, kombinert med sin stramme begrensning av vascular forsyning, kunne nøyaktig måling av ATP forbruk i netthinnen og dens endringer under sykdom ha dyptgripende implikasjoner i forståelse og behandling blendende retinitis pigmentosa og diabetisk retinopati. Tradisjonelt har krever disse målingene kostbar, spesialdesignet utstyr med de fleste studier fremvoksende fra en håndfull laboratorier helt dedikert til målinger metabolsk aktivitet2,5,6, 7,8. Teknikker inkluderer individuelle analyser for bestemte metabolitter, tracer studier med radio-merket forløpere, oksygenforbruk opptak med Clark elektroder og metabolomic profilering9.
Med fremskritt innen høy gjennomstrømming teknologi og økt tilgjengelighet av kommersielle enheter er teknikker for å registrere retinal metabolisme stadig mer tilgjengelig og rimelig. Metoden beskrevet her måler både oxidative fosforylering og Glykolysen netthinnen ved explanted vev og en kommersielt tilgjengelig ekstracellulære flux analyzer9,10,11,12. Denne analyzer registreres separat oksygen forbruksraten (OCR) og den ekstracellulære forsuring rate (ECAR), som indirekte indikatorer på oxidative fosforylering og Glykolysen, henholdsvis13. Disse målingene er gjort av en sonde senket i en microchamber opprettet over vevet rundt. Denne tilpasningen av tidligere publiserte metoder bruker en fange plate opprinnelig utviklet for bukspyttkjertelen holmer Langerhans registrere metabolsk aktivitet i liten, rundskriv deler av musen netthinnen. Flere farmakologisk eksponeringer kan leveres til vev i løpet av en enkelt opptak fordi systemet inneholder 4 injeksjon porter for hver prøve også. Bruke dette systemet med separat protokoller optimalisert for ECAR og OCR, svarene på vill-type Netthinne kan sammenlignes Netthinne mangler transducin (Gnat1– / –), en årsak til medfødt stasjonære nattblindhet i mennesker14.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCR og ECAR måles lett i explanted netthinnen vev ved hjelp av en bioanalyzer ved hjelp av beskrevet teknikker. Denne metoden avviker fra de andre grupper i flere viktige trinn. Netthinnen vev er isolert gjennom en stor hornhinnen snitt uten enucleating i verden, som opprinnelig ble beskrevet av Winkler15. Denne metoden retinal isolasjon gjør en rask overføring fra levende øyet inn i vev fange plate (ofte innen 5 minutter). Vev holdes på 37 ° C hele prosessen, som bevarer cellular respirasjo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Alexander Kolesnikov og Dr. Vladimir Kefalov for å gi Gnat1– / –mus, for nyttig tilbakemelding og råd og lese manuskriptet.
Dette arbeidet ble støttet av NIH EY025269 (RR), Diabetes Research Center ved Washington University – ya DK020579 (JRM og RR), en karriere Development Award fra forskning hindre blinde (RR), Horncrest Foundation (RR), en karriere Development Award fra JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) og DK114233 (JRM).
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
