Fabrication d’échafaudages Decellularise dérivé de Cartilage Matrix
Summary
Decellularise dérivés de cartilage échafaudages peuvent être utilisés comme un échafaudage pour la réparation du cartilage guide et comme un moyen de régénérer le tissu ostéochondral. Cet article décrit le processus de décellularisation en détail et offre des suggestions pour utiliser ces échafaudages en milieu in vitro.
Abstract
Cartilagineuses défauts n’ont pas une capacité suffisante de réparation intrinsèque pour régénérer fonctionnellement son tissu osseux et du cartilage. Dans cette mesure, recherche de cartilage a mis l’accent sur l’élaboration d’échafaudages régénératrices. Cet article décrit le développement d’échafaudages entièrement dérivées de la matrice extracellulaire du cartilage naturel, provenant d’un donneur équin. Les applications potentielles des échafaudages incluent la production allogreffes pour la réparation du cartilage, agissant comme un échafaudage pour tissu ostéochondral ingénierie et en fournissant des modèles in vitro afin d’étudier la formation des tissus. Par decellularizing le tissu, les cellules du donneur sont supprimés, mais beaucoup d’entre les repères naturels bioactifs sont censés être conservés. L’avantage principal d’utiliser tel un échafaudage naturel par rapport à un échafaudage synthétiquement produit est qu’aucun autre fonctionnalisation des polymères n’est nécessaire à la régénération des tissus cartilagineuses du lecteur. Les échafaudages de matrice dérivée du cartilage peuvent être utilisés pour la régénération des tissus osseux et cartilagineux dans les milieux tant in vivo qu’in vitro.
Introduction
Défauts de cartilage articulaire au genou causée par des événements traumatisants peuvent conduire à l’inconfort et surtout peuvent avoir un impact important sur la vie de la population jeune et active1,2,3. En outre, les lésions du cartilage à un jeune âge peuvent entraîner une apparition plus rapide de l’arthrose plus tard dans la vie4. Actuellement, la seule thérapie de récupération généralisée d’arthrose du genou est la chirurgie de remplacement de l’articulation. Le cartilage est un hypocellular, aneural et tissu avasculaire, sa capacité de régénération est sévèrement limitée. Par conséquent, des approches de la médecine régénératrice sont recherchées pour aider et stimuler la capacité de régénération du tissu native. À cette fin, les échafaudages sont conçus et utilisés comme soit un porte-cellule ou un matériel inductif qui incite à la différenciation et la régénération des tissus par cellules natives5 du corps.
Échafaudages decellularise ont été largement étudiés au sein de la médecine régénérative,6. Il a eu un certain succès, par exemple, en aidant la régénération de la peau7structures abdominales8et tendons9. L’avantage de l’utilisation des échafaudages decellularise est leur origine naturelle et leur capacité à retenir des indices bioactifs qui attirent et induisent la différenciation cellulaire dans la lignée appropriée requise pour la réparation de tissus6,10. En outre, puisque la matrice extracellulaire (ECM) est un biomatériau naturel et décellularisation empêche une immuno-réaction potentielle en supprimant le contenu cellulaire ou génétique, questions au sujet de la biocompatibilité et la biodégradabilité sont surmontées.
Échafaudages de matrice dérivée du cartilage (MDP) ont montré chondrogéniques grand potentiel dans des expériences in vitro lorsque ensemencée avec des cellules stromales mésenchymateuses11. En outre, ces échafaudages ont montré le potentiel de tissu osseux forme par le biais de l’ossification endochondrale sur emplacements ectopiques dans paramètres in vivo12. Que MDP échafaudages guident la formation des deux os et du tissu cartilagineux, ces échafaudages peuvent tenir potentiels pour la réparation de défauts cartilagineuses en plus de la réparation du cartilage.
Cet article décrit un protocole adapté de Yang et coll. (2010)13 pour la fabrication d’échafaudages de MDP decellularise d’équins étouffer du cartilage. Ces échafaudages sont riches en collagène de type II et dépourvue de cellules et ne contiennent pas des glycosaminoglycanes (GAGs) après décellularisation. Des expériences in vitro et in vivo sur la réparation de défauts chondrales (osteo) peuvent être effectuées à l’aide de ces échafaudages.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ECM du cartilage articulaire est très dense et très résistant aux différents traitements enzymatiques. Le protocole décellularisation plusieurs étapes décrit dans cet article traite de cette résistance et avec succès génère des matrices decellularise. Pour y parvenir, le processus s’étend sur plusieurs jours. De nombreux processus de décellularisation ont été proposées pour différents types de tissus18, et cet article décrit un protocole adapté à la décellularisation du …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimerait W. Boot pour aide à la production d’échafaudages. Cintreuses de Kaka est supporté par le Alexandre Suerman Stipendium de l’University Medical Center. Levato R. et J. Malda sont soutenus par la Fondation néerlandaise de l’arthrite (subvention accords CO-14-1-001 et LLP-12, respectivement).
Materials
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlight S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
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