Fabricação de matriz de cartilagem-derivado Decellularized andaimes
Summary
Decellularized andaimes derivado de cartilagem podem ser usados como um andaime para guia de reparação da cartilagem e como um meio para regenerar o tecido osteocondral. Este documento descreve o processo de decellularization em detalhes e fornece sugestões para usar estes andaimes em configurações in vitro.
Abstract
Defeitos osteocondrais faltam capacidade intrínseca reparação suficiente para regenerar tecidos funcionalmente som do osso e cartilagem. Nesta medida, cartilagem pesquisa centrou-se no desenvolvimento de andaimes regenerativas. Este artigo descreve o desenvolvimento de andaimes que derivam-se completamente da matriz extracelular da cartilagem natural, vindo de um doador de equino. As aplicações potenciais dos andaimes incluem produzindo aloenxertos para reparação da cartilagem, servindo como um andaime para tecido osteocondral engenharia e fornecendo modelos in vitro para estudar a formação de tecido. Por decellularizing o tecido, as células do dador são removidas, mas muitas das dicas bioativas naturais são pensadas para ser mantido. A principal vantagem do uso de um andaime tão natural em comparação com um andaime produzido sinteticamente é que não mais functionalization de polímeros é necessária para a regeneração do tecido osteocondral unidade. Os matriz da cartilagem-derivado andaimes podem ser usados para a regeneração de tecidos do osso e cartilagem nas configurações tanto in vivo e in vitro.
Introduction
Defeitos da cartilagem articular no joelho causadas por eventos traumáticos podem levar ao desconforto e acima de tudo, podem ter um grande impacto na vida da população jovem e ativo1,2,3. Além disso, danos na cartilagem em uma idade jovem podem levar a um início mais rápido da osteoartrite mais tarde na vida4. Atualmente, a única terapia de resgate para osteoartrite generalizada do joelho é a cirurgia de substituição articular. Como a cartilagem é um tecido avascular, aneural e hipocelular, sua capacidade regenerativa é severamente limitada. Portanto, abordagens de medicina regenerativa são procuradas para ajudar e estimular a capacidade regenerativa do tecido nativo. Para esta finalidade, os andaimes são projetados e usados como qualquer célula-portador ou como um material indutivo que incita a diferenciação e regeneração do tecido nativo células5 do corpo.
Decellularized andaimes têm sido amplamente estudados dentro medicina regenerativa6. Teve algum sucesso, por exemplo, em ajudar a regeneração da pele7, estruturas abdominal8e tendões9. A vantagem de usar andaimes decellularized é sua origem natural e sua capacidade de reter as sugestões bioativas que atraem e induzem a diferenciação celular em linhagem adequada necessária para reparação de tecido6,10. Além disso, desde que a matriz extracelular (ECM) é um biomaterial natural, e decellularization impede uma resposta imune potencial removendo conteúdo celular ou genético, questões relativas à biocompatibilidade e biodegradabilidade são superados.
Andaimes de matriz de cartilagem-derivado (CDM) demonstraram chondrogenic grande potencial em experimentos in vitro, quando inoculado com células estromais mesenquimais11. Além disso, estes andaimes têm mostrado o potencial para o tecido ósseo de forma através da ossificação endocondral localizações ectópicas em configurações vivo em12. Como andaimes CDM orientar a formação de ambos nos ossos e tecido cartilaginoso, estes andaimes podem ter potenciais para reparação de defeitos osteocondrais além de reparação da cartilagem.
Este artigo descreve um protocolo adaptado de Yang et al (2010)13 para a produção de andaimes de MDL decellularized de equino sufocar a cartilagem. Estes andaimes são ricos em colágeno tipo II e desprovida de células e não contêm qualquer glicosaminoglicanos (GAGs) após decellularization. Experimentos in vitro e in vivo no reparo de defeito condral (osteo) podem ser realizados usando estes andaimes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A ECM da cartilagem articular é muito denso e bastante resistente a tratamentos enzimáticos diferentes. O protocolo de decellularization de várias etapas descrito neste artigo aborda tal resistência e com êxito gera matrizes decellularized. Para conseguir isso, o processo se estende durante vários dias. Muitos processos de decellularization têm sido propostos para os diferentes tipos de tecidos,18, e este artigo descreve um protocolo apropriado para o decellularization da cartilagem. Neste …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de reconhecer o Boot W. para assistência na produção dos andaimes. K.E.M. Benders é suportado pelo Alexandre Suerman Stipendium do University Medical Center. Levato R. e J. Malda são suportados pela Fundação holandesa de artrite (conceder acordos CO-14-1-001 e LLP-12, respectivamente).
Materials
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlight S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
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