Herstellung von Decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüste
Summary
Decellularized Knorpel stammenden Gerüste als ein Gerüst, um Führer Knorpelreparatur sowie ein Mittel lässt sich um osteochondrale Gewebe zu regenerieren. Dieses Papier beschreibt den Decellularization Prozess im Detail und enthält Vorschläge, diese Gerüste in in-vitro-Einstellungen zu verwenden.
Abstract
Osteochondrale Defekte fehlen ausreichende intrinsische Reparatur Kapazität, funktionell gesunde Knochen und Knorpel Gewebe zu regenerieren. Insofern hat Knorpel Forschungsschwerpunkt auf die Entwicklung der regenerativen Gerüste. Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung von Gerüsten, die vollständig aus natürlichen Knorpel extrazelluläre Matrix, aus einem equine Spender stammen. Mögliche Anwendungen der Gerüste sind produzieren Allografts für Knorpelreparatur, dienen als Gerüst für osteochondrale Tissue engineering und Bereitstellung von in-vitro-Modellen um Gewebeanordnung zu studieren. Von einem Gewebe, die Spenderzellen werden entfernt, aber viele der natürlichen bioaktiven Cues werden gedacht, um beibehalten werden. Der wesentliche Vorteil der Verwendung einer natürlichen Gerüst im Vergleich zu einem synthetisch hergestellten Gerüst ist, dass keine weiteren Funktionalisierung von Polymeren Laufwerk osteochondrale Geweberegeneration erforderlich ist. Die Knorpel-abgeleitete Matrix-Gerüste können für Knochen und Knorpel Geweberegeneration in in vivo und in vitro-Einstellungen verwendet werden.
Introduction
Mängel der Gelenkknorpel im Knie verursacht durch traumatische Ereignisse können zu Unbehagen führen, und vor allem können haben einen großen Einfluss auf das Leben der jungen und aktiven Bevölkerung1,2,3. Darüber hinaus kann Knorpelschäden an einem jungen Alter zu einen schnelleren Wirkungseintritt Arthrose später im Leben4führen. Derzeit ist die einzige Salvage-Therapie für generalisierte Osteoarthritis des Knies Gelenkersatz. Knorpel ist ein Hypocellular, Aneural und avaskuläre Gewebe, ist seine Regenerationsfähigkeit stark eingeschränkt. Regenerative Medizin Ansätze sind daher begehrt zu helfen und die Regenerationsfähigkeit der nativen Gewebe zu stimulieren. Zu diesem Zweck sind Gerüste entwickelt und verwendet als entweder Zellträger oder als eine induktive Material, die stachelt Differenzierung und Regeneration des Gewebes durch den Körper native Zellen5.
Decellularized Gerüste sind weit verbreitet in der regenerativen Medizin6untersucht worden. Es hatte einige Erfolge, beispielsweise bei der Unterstützung der Regeneration der Haut7, Abdominal-Strukturen8und Sehnen9. Der Vorteil der Verwendung decellularized Gerüste ist ihre natürlichen Ursprungs und ihre Fähigkeit, bioaktive Hinweise zu behalten, die sowohl anziehen und Zelldifferenzierung in der entsprechenden Linie für Gewebe-Reparatur-6,–10erforderlich induzieren. Darüber hinaus sind da extrazellulärer Matrix (ECM) eine natürliche Biomaterialien ist und Decellularization eine mögliche Immunantwort verhindert durch Entfernen von zellulären oder genetischen Inhalten, Fragen der Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit überwinden.
Knorpel-abgeleitete Matrix (CDM) Gerüste haben große Chondrogenic im in-vitro-Experimente, wenn mit mesenchymaler Stromazellen Zellen11ausgesät gezeigt. Darüber hinaus haben diese Gerüste das Potenzial, Form Knochengewebe durch Endochondral Verknöcherung auf ektopische Standorte in in-vivo Einstellungen12gezeigt. CDM-Gerüste führt die Bildung von beide Knochen und Knorpelgewebe, diese Gerüste Potenzial für osteochondrale defekt Reparatur neben Knorpelreparatur halten können.
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll adaptiert von Yang Et Al. (2010)13 für die Herstellung von decellularized CDM-Gerüste von Equine ersticken Knorpel. Diese Gerüste sind reich an Kollagen Typ II und frei von Zellen und enthalten Glykosaminoglykane (GAGs) nach Decellularization. In vitro und in vivo Experimente an (Osteo) Chondral defekt Reparatur können mit diesen Gerüsten durchgeführt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das ECM des Gelenkknorpels ist sehr dicht und sehr widerstandsfähig gegenüber verschiedenen enzymatischen Behandlungen. In diesem Artikel beschriebenen mehrstufigen Decellularization-Protokoll befasst sich mit solchen Widerstand und erfolgreich erzeugt decellularized Matrizen. Um dies zu erreichen, erstreckt sich der Prozess über mehrere Tage. Viele Decellularization Prozesse sind für verschiedene Arten von Gewebe18vorgeschlagen worden, und dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Dece…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten W. Boot für Hilfe bei der Herstellung der Gerüste zu bestätigen. K.E.M. Benders stützt sich auf die Alexandre Suerman Stipendium vom University Medical Center. R. Levato und J. Malda werden von der niederländischen Arthritis Foundation unterstützt (Finanzhilfevereinbarungen CO-14-1-001 und LLP-12, beziehungsweise).
Materials
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlight S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
- Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
- Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
- Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes’ knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
- Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
- Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
- Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
- Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
- Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
- Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
- Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
- Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683 (2013).
- Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).
