脱軟骨由来のマトリックス足場の作製
Summary
軟骨由来足場の脱は、軟骨組織を再生する手段として、ガイド軟骨修復の足場として使用できます。本稿は decellularization プロセスの詳細について説明します体外の設定でこれらの足場を使用するための提案を提供しています。
Abstract
膝骨軟骨骨欠損は、機能的サウンドの骨・軟骨の組織を再生する十分な組み込み修復能力を欠いています。この意味において、軟骨研究は、再生の足場の開発に集中しています。この資料では、馬のドナーから来る自然な軟骨の細胞外マトリックスに由来する完全に足場の開発について説明します。足場の潜在的なアプリケーションは、同種骨軟骨組織エンジニア リング、および研究組織を形成する生体外モデルを提供のための足場として、軟骨修復のための生産を含まれます。組織を decellularizing、ドナー細胞が削除されますが、天然の生理活性キューの多くは保持されると考えられています。総合的作り出された足場と比較してこのような自然な足場を使用しての主な利点は、高分子材料のさらなる高機能化がドライブ軟骨組織再生に必要ないことです。軟骨由来の足場は、体内と体外の両方の設定で骨・軟骨の組織再生に使用できます。
Introduction
衝撃的な出来事によって引き起こされる膝の関節軟骨欠損、不快感につながることが、とりわけ若くてアクティブな人口1,2,3の生活に大きな影響を持つことができます。さらに、若い年齢で軟骨の損傷はライフ4で変形性関節症のより急速な発症をもたらすかもしれない。現在、一般化された変形性膝関節に対する唯一のサルベージ療法は関節置換手術です。軟骨は、hypocellular、aneural と無血管組織、その再生能力は厳しく限られるです。したがって、再生医療のアプローチは、ネイティブの組織の再生能力を促し、援助に引っ張りだこに。この目的のため足場が設計され、体のネイティブ セル5携帯会社のいずれか、または分化と組織再生を誘発する誘導物質としてを使用します。
脱足場は、再生医療6内で広く研究されています。それは、皮膚7、腹部の構造8、および腱9の再生支援でたとえば、いくつかの成功を収めています。脱足場を使用の利点は、自然起源および両方を誘致し組織修復6,10に必要な適切な系統に分化を誘導する生理活性の手がかりを保持するための能力です。さらに、細胞外マトリックス (ECM) は自然な生体材料、decellularization は細胞や遺伝子のコンテンツを削除することによって潜在的な免疫応答を防ぐことができますので、生体適合性と生分解性に関する問題は克服されます。
軟骨由来のマトリックス (CDM) 足場 in vitro 実験間葉系間質細胞11シードされるとき潜在的な偉大な軟骨を示しました。さらに、これらの足場は、体内の設定12内の異所性の場所にフォーム骨軟骨内骨化をする可能性を示しています。CDM 足場の形成を導く両方の骨、軟骨、これらの足場が軟骨修復に加えて骨軟骨欠損修復の可能性を持します。
ヤンから適応プロトコルについて説明しますet al. (2010)13の生産馬から脱 CDM 足場のため軟骨を抑えます。これらの足場は II 型コラーゲンと細胞に欠けている裕福な decellularization 後任意のグリコサミノグリカン (Gag) が含まれていません。これらの足場を使用 (骨) 軟骨欠損修復の in vitro および in vivo 実験が行なえます。
Protocol
Representative Results
Discussion
関節軟骨の ECM は非常に密、さまざまな酵素治療法にかなり弾力性のあります。この記事で記述されている多段 decellularization プロトコルはそのような抵抗に対処し、脱行列が正常に生成されます。それを達成するには、プロセスは、数日間かけてまたがります。多くの decellularization プロセスが提案されているさまざまな種類の組織の18と軟骨の decellularization に適したプロト…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、足場の生産について w. ブートを認めたいと思います。K.E.M. ベンダーは大学医療センターからアレクサンドル ・ Suerman Stipendium によってサポートされます。R. Levato、j. マルダはオランダの関節炎財団によってサポートされて (付与契約 CO-14-1-001 と LLP-12、それぞれ)。
Materials
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlight S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
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