تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي الماوس باستخدام الفرز اليدوي وضعف في المختبر النسخ تهم المطلق بالتسلسل (DIVA-Seq)
Summary
ويصف هذا البروتوكول دليل الفرز الداخلي لعزل الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي واحدة تليها في المختبر على أساس النسخ التضخيم مرناً لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة عالية والعمق.
Abstract
خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي (الرنا-seq) الآن أداة تنفذ على نطاق واسع للمعايرة التعبير الجيني. منصات تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة متاحة تجارياً عملية خلايا الإدخال جميعا دون تمييز. في بعض الأحيان، يتم استخدام الخلية المنشط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) المنبع لعزل سكان على وجه التحديد مسمى للفائدة. حد من نظام مراقبة الأصول الميدانية هو الحاجة إلى إعداد كبيرة من خلايا الإدخال مع كسور المسمى إلى حد كبير، وغير عملي لجمع وتوصيف السكان العصبية نادرة أو قليلة مسماة من الدماغ الماوس. هنا، نحن تصف طريقة يدوياً جمع متفرق المسمى فلوريسسينتلي واحدة من الخلايا العصبية من طازجة نات بأنسجة المخ الماوس. تسمح هذه العملية لالتقاط المسمى واحد الخلايا العصبية مع درجة نقاء عالية والتكامل اللاحقة مع بروتوكولا تضخيم المستندة إلى النسخ في المختبر أن يحافظ على نسب النسخة المحلية. يمكننا وصف أسلوب تضخيم خطي مزدوج يستخدم معرفات فريدة من نوعها جزيء (أوميس) لتوليد الفرد مرناً التهم. جولتين من نتائج التضخيم في درجة عالية من اكتشاف الجينات كل خلية مفردة.
Introduction
وقد تحول خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي (الرنا-seq) دراسات ترانسكريبتوميك. وفي حين يمكن إجراء رناسيق خلية واحدة على نطاق واسع باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات، مثل قطرات1،2، ميكروفلويديكس3، نانوجريدس4و5من ميكروويلس، معظم الأساليب لا يمكن فرز أنواع الخلايا المحددة أن التعبير عن فلوروفوريس وراثيا المرمزة. لعزل سكان تحديد خلية، غالباً fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لفرز الخلايا المسماة في وضع خلية واحدة. ومع ذلك، نظام مراقبة الأصول الميدانية بعض قيود ويتطلب خطوات تجهيز العينة الدقيق. أولاً، عدد كبير من خلايا الإدخال عادة حاجة (غالباً عدة ملايين الخلايا كل مل)، مع جزء كبير (> 15 – 20%) التي تحتوي على السكان المسمى. ثانيا، قد تتطلب استعدادات خلية جولات متعددة من كثافة الطرد المركزي التدرج الخطوات لإزالة جزء الدبقية، والحطام، وكتل الخلايا التي قد تسد إلا الخلية فوهة أو تدفق. ثالثا، نظام مراقبة الأصول الميدانية توظف عادة تلطيخ وديستاينينج خطوات للعيش/الميت تلطيخ (مثلاً من 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، يوديد propidium (PI)، والأصباغ سيتوتراكير)، الذي يستغرق وقتاً إضافيا. الرابع، كما أن هناك حاجة إلى قاعدة عامة اللونين الفرز (مثل DAPI والبروتين الأخضر الأحمر نيون (التجارة والنقل/RFP))، عادة ما تكون العينتين وعنصر تحكم واحد، التي تتطلب عينة غير مسمى بحيث تتم معالجتها بالإضافة إلى سلالة الماوس المطلوب. خامسا، تصفية غالباً ما تتم عدة مرات قبل وأثناء الفرز عينة شكل استباقي منع الأسطر عينة انسداد في جهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية. سادسا، يجب تخصيص وقت في الأجهزة نظام مراقبة الأصول الميدانية الأكثر استخداماً تهيئة واستقرار تدفق السوائل وإجراء المعايرة الحبرية. مراقبة السابعة، يتم عادة تشغيل عينات في تسلسل قبل جمع العينة الفعلية لإعداد مصفوفات التعويض، ورفض يبنوا، تعيين غيتس، مستخدمين إلخ أما ستة وسبعة أنفسهم قبل الموعد المحدد بالخطوات أو تتطلب مساعدة فني بالتوازي. وأخيراً، وظيفة-نظام مراقبة الأصول الميدانية، غالباً ما تكون هناك خطوات للتأكد من أن فقط تسمية واحدة خلايا موجودة في كل بئر؛ على سبيل المثال، بفحص عينات في إعداد فحص محتوى عالية مثل تصوير لوحة سريع.
للتحايل على الخطوات المذكورة أعلاه وتيسير سريعة نسبيا، تستهدف تتابعها من عدد صغير من السكان من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي واحد، يصف لنا دليل الفرز الإجراء متبوعاً بجولتين من درجة عالية من الحساسية في المختبر بروتوكول التضخيم، دعا مزدوجة في المختبر النسخ تهم المطلق بالتسلسل (DIVA-Seq). الجيش الملكي النيبالي التضخيم وكدنا توليد المكتبة مقتبسة من أبرون et al. 6 وهاشيمشوني et al. 7، مع إجراء بعض التعديلات لتناسب إينتيرنيورونس الماوس التي لديها كميات أصغر الخلوية؛ وعلاوة على ذلك، وجدنا أيضا أن من المفيد أيضا للخلايا العصبية الهرمية عليه.
Protocol
Representative Results
Discussion
دليل الفرز البروتوكول مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي تحت إشراف العصبية المسمى في الدماغ الفئران السكان التي أما أن تكون قليلة أو التي تمثل سكان خلية نادرة أن خلاف ذلك ليس عمليا لدراسة استخدام الخلية الفائق الحالية أساليب الفرز والتضخيم. الخلايا التي تخضع لنظام مراقبة الأصول الميداني?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5R01MH094705-04 و R01MH109665-01 إلى Z.J.H.)، كشل روبرتسون علم الأعصاب الصندوق (Z.J.H.)، ونارساد شواغر زمالة (أ فب).
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
- Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
- Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
- Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
- Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
- Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
- Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
- Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
