Secuenciación de ARN unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación Manual y doble transcripción In Vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq)
Summary
Este protocolo describe el manual de clasificación procedimiento para aislar neuronas fluorescencia etiquetadas solo seguidas en vitro basada en la transcripción ARNm amplificación de la secuencia de RNA de alta profundidad unicelular.
Abstract
Secuencia de RNA (RNA-seq) del unicelular es ahora una herramienta ampliamente implementada para análisis de expresión génica. Disponible en el mercado plataformas de secuenciación del RNA unicelular procesan todo entradas células indiscriminadamente. Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación se utiliza a veces, contra la corriente para aislar a una población específicamente etiquetada de interés. Una limitación de FACS es la necesidad de un número elevado de células entradas con fracciones significativamente marcadas, que no es práctico para la recogida y perfiles de poblaciones raras o escasamente marcada neurona del cerebro del ratón. Aquí, describimos un método para manualmente recoger escasa fluorescencia etiquetada neuronas solo de recién disociados tejido de cerebro de ratón. Este proceso permite capturar las neuronas solo etiquetados con pureza elevada y posterior integración con un protocolo en vitro amplificación basada en la transcripción que conserva relaciones de transcripción endógena. Se describe un método de doble amplificación lineal que utiliza identificadores de molécula única (UMIs) para generar cuentas de ARNm individuales. Dos rondas de los resultados de amplificación en un alto grado de detección de genes por célula.
Introduction
Secuencia de RNA (RNA-seq) del unicelular ha transformado estudios transcriptómico. Mientras que a gran escala unicelular RNAseq puede realizarse usando una variedad de técnicas, como gotitas1,2, microfluídica3, nanogrids4y5de los micropocillos, mayoría de los métodos no puede ordenar tipos celulares definidas expresan fluoróforos genéticamente codificados. Para aislar a una población selecta de la célula, célula activada por fluorescencia (FACS) de clasificación es de uso frecuente para clasificar las células etiquetadas en el modo de una sola célula. Sin embargo, FACS tiene algunas restricciones y requiere de etapas de procesamiento de una muestra. En primer lugar, un gran número de células de entrada es típicamente necesarios (a menudo varios millones células / mL), con una fracción significativa (> 15-20%) que contiene la población marcada. En segundo lugar, preparaciones celulares pueden requerir múltiples rondas de pasos de centrifugación del gradiente de densidad para eliminar la fracción glial, escombros y montones de celulares que de lo contrario podrían obstruir la boquilla o flujo de la célula. En tercer lugar, FACS generalmente emplea la coloración y los pasos para live/dead tinción (por ejemplo, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), yoduro de propidio (PI) y colorantes de Cytotracker), que toman más tiempo de extracción. En cuarto lugar, como regla general para la clasificación (como DAPI y proteína fluorescente verde y rojo (GFP/RFP)), generalmente dos muestras de dos colores y un control son necesarios, que requieren una muestra sin etiqueta para ser procesados además de la cepa de ratón deseado. En quinto lugar, filtrado a menudo se realiza varias veces antes y durante la clasificación de la muestra para evitar proactivamente obstruido muestra líneas en una máquina de FACS. En sexto lugar, debe asignarse tiempo en configuraciones de FACS más comúnmente utilizadas para inicializar y estabilizar el flujo y realizar la calibración de la gota. Séptimo, control de muestras normalmente se ejecutan en secuencia antes de la colección de la muestra real para configurar matrices de compensación, rechazo de doblete, puertas, etc. usuarios o realice los pasos seis y siete se antes de tiempo o requieren la asistencia de un técnico en paralelo. Por último, post-FACS, hay a menudo medidas para asegurar que sólo con la etiqueta solo las células están presentes en cada pozo; por ejemplo, revisando las muestras en una instalación de proyección de alto contenido como un toner de la placa rápida.
Para eludir los pasos descritos arriba y facilitar una relativamente rápida, dirigida la secuencia de una población pequeña de neuronas fluorescencia etiquetadas sola, describimos un manual de clasificación procedimiento seguido por dos rondas de una alta sensibilidad in vitro Protocolo de amplificación, llamado doble transcripción de in vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq). La generación de biblioteca de cDNA y amplificación de RNA está adaptada de Eberwine et al. 6 y Hashimshony et al. 7, con algunas modificaciones para todos los interneurons de ratón que tienen volúmenes celulares más pequeños; Además, también hemos encontrado que es igualmente útil para neuronas piramidales excitatorias.
Protocol
Representative Results
Discussion
El manual de clasificación de protocolo es adecuado para una secuencia de RNA supervisada de neurona las poblaciones que son escasamente marcados en el cerebro de ratones o representan a una población de células raras que de lo contrario no es factible estudiar con células de alto rendimiento actual métodos de selección y amplificación. Las células sometidas a FACS generalmente se someten a las presiones de línea de vaina y muestra en la gama de ~ 9 – 14 psi, dependiendo del tamaño de la boquilla y deseado de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH (5R01MH094705-04 y R01MH109665-01 a Z.J.H.), por el CSHL Robertson Neurociencia fondo (Z.J.H.) y por una beca Post-Doctoral de NARSAD (a A.P.).
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
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