Eencellige RNA Sequencing van Fluorescently geëtiketteerde muis neuronen met behulp van handmatig sorteren en dubbele In Vitro transcriptie met Absolute aantallen Sequencing (DIVA-Seq)
Summary
Dit protocol beschrijft de procedure om te isoleren van één fluorescently geëtiketteerde neuronen gevolgd door in vitro transcriptie gebaseerde mRNA versterking voor hoge-diepte eencellige RNA sequencing sorteren handleiding.
Abstract
Eencellige RNA sequencing (RNA-seq) is nu een grote schaal uitgevoerde hulpmiddel voor het analyseren van genexpressie. Commercieel beschikbare eencellige RNA-sequencing platforms verwerken alle invoercellen lukraak. Fluorescentie-activated cell sorting (FACS) wordt soms stroomopwaarts gebruikt voor het isoleren van een specifiek gelabelde bevolking van belang. Een beperking van FACS is de noodzaak voor hoge aantallen invoercellen met aanzienlijk gelabelde breuken, onpraktisch voor het verzamelen en profilering van zeldzame of dunbevolkte gelabelde neuron populaties van de hersenen van de muis. Hier beschrijven we een methode voor het handmatig verzamelen van sparse fluorescently label één neuronen van vers losgekoppeld muis hersenweefsel. Dit proces zorgt voor het vastleggen van single-geëtiketteerden neuronen met hoge zuiverheid en verdere integratie met een in vitro transcriptie gebaseerde amplificatie protocol dat endogene transcript verhoudingen behouden. We beschrijven een dubbele lineaire versterking-methode die unieke molecuul-id’s (UMIs) gebruikt voor het genereren van afzonderlijke mRNA graven. Twee rondes van versterking resulteert in een hoge mate van gene detectie per eencellige.
Introduction
Eencellige RNA sequencing (RNA-seq) heeft transcriptomic studies getransformeerd. Terwijl de grootschalige eencellige RNAseq kan worden uitgevoerd met behulp van een verscheidenheid van technieken, zoals druppels1,2, microfluidics3, nanogrids4en5van het microwells, sorteren de meeste methoden gedefinieerd celtypes niet die genetisch gecodeerde fluorophores express. Isoleren van een select-celpopulatie, wordt fluorescentie-activated cell sorting (FACS) vaak gebruikt voor het sorteren van gelabelde cellen in de modus van een eencellige. Er zijn enkele beperkingen heeft echter FACS en vereist zorgvuldige monster verwerking stappen. Ten eerste, een groot aantal invoercellen zijn meestal nodig (vaak meerdere miljoen cellen per mL), met een belangrijke fractie (> 15-20%) met de gelabelde bevolking. Ten tweede, cel preparaten mogelijk meerdere rondes van dichtheid kleurovergang centrifugeren stappen voor het verwijderen van gliale breuk, puin en cel bosjes die anders de mondstuk of stroom cel verstoppen misschien. Ten derde, FACS werken meestal kleuring en destaining stappen voor live/dead kleuring (bijvoorbeeld 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) propidium jodide (PI) en Cytotracker kleurstoffen), die extra tijd in beslag nemen. Ten vierde, als een vuistregel voor twee kleuren sorteren (zoals DAPI en groen/rood fluorescente proteïne (GFP/RFP)), meestal twee monsters en één besturingselement nodig zijn, vereisen een labelloze monster naast de gewenste muis stam worden verwerkt. Ten vijfde: filteren wordt vaak uitgevoerd meerdere malen vóór en tijdens het monster sorteren om proactief te voorkomen dat verstopte monster lijnen in een FACS machine. Ten zesde moet tijd worden toegewezen in de meest gebruikte FACS opstellingen te initialiseren en te stabiliseren van de vloeistof stroom druppel kalibratie uit te voeren. Zevende, controle monsters worden meestal uitgevoerd in volgorde vóór het verzamelen van feitelijke monster om compensatie matrices, doublet afwijzing instellen, instellen van poorten, etc. gebruikers ofwel stappen zes en zeven zich tevoren of vereisen de hulp van een technicus in parallel. Ten slotte, post-FACS, er zijn vaak stappen om ervoor te zorgen dat alleen het label enkele cellen aanwezig in elk putje; bijvoorbeeld door het controleren van monsters bij een instelling met hoog-content screening zoals een snelle plaat imager.
Omzeilen van de bovenstaande stappen te vergemakkelijken een relatief snelle, gerichte sequencing van een kleine populatie van één fluorescently geëtiketteerde neuronen, beschrijven we een handleiding sorteren procedure gevolgd door twee rondes van een hooggevoelige in vitro versterking protocol, dubbele in-vitro transcriptie met absolute aantallen sequencing (DIVA-Seq) genoemd. De RNA-versterking en cDNA Bibliotheek generatie zijn aangepast van Eberwine et al. 6 en Hashimshony et al. 7, met enkele wijzigingen aan de muis interneuronen hebben kleinere cellulaire volumes; Bovendien, we hebben ook geconstateerd dat er even nuttig voor excitatory piramidale neuronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De handleiding sorteren protocol is geschikt voor een gecontroleerde RNA sequencing van neuron populaties die dun met de label in de hersenen van muizen of vertegenwoordigen een zeldzame celpopulatie die anders niet haalbaar is om te studeren met behulp van de huidige high-throughput cel Sorteer- en versterking methoden. Cellen die zijn onderworpen aan FACS meestal ondergaan schede en monster lijn druk in het bereik van ~ 9-14 psi, afhankelijk van de grootte van het mondstuk en gewenste gebeurtenis tarieven. Daarnaast op…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de NIH (5R01MH094705-04 en R01MH109665-01 tot en met Z.J.H.), door het CSHL Robertson Neuroscience Fonds (Z.J.H.) en door een NARSAD Post-Doctoral Fellowship (naar A.P.).
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
- Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
- Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
- Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
- Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
- Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
- Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
- Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
