Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)
Summary
Este protocolo descreve o manual de procedimento para isolar o único neurônios fluorescente etiquetados seguidos em vitro baseada na transcrição de amplificação do mRNA para a sequenciação do ARN de alta profundidade única célula de triagem.
Abstract
A sequenciação do ARN unicelulares (RNA-seq) agora é uma ferramenta amplamente implementada para análise de expressão gênica. Plataformas de sequenciação do ARN monocelulares comercialmente disponíveis processam tudo entradas células indiscriminadamente. Às vezes, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é usada contra a corrente para isolar uma população especificamente rotulada de interesse. Uma limitação de FACS é a necessidade de números elevados de células entradas com frações significativamente rotuladas, que é impraticável para coleta e criação de perfil de populações raras ou escassamente rotulada neurônio do cérebro do rato. Aqui, descrevemos um método para manualmente coletando esparsas fluorescente etiquetado único neurônios de recém dissociado tecido de cérebro de rato. Este processo permite a captura de neurônios com rótulo único com pureza elevada e subsequente integração com um em vitro protocolo de amplificação baseada na transcrição que preserva os rácios de transcrição endógena. Nós descrevemos um método de amplificação linear duplo que usa identificadores da molécula original (UMIs) para gerar contagens individuais do mRNA. Duas rodadas de resultados de amplificação em um alto grau de deteção de gene por uma única célula.
Introduction
A sequenciação do ARN unicelulares (RNA-seq) transformou-se estudos de transcriptomic. Enquanto em grande escala RNAseq de célula única pode ser executada usando uma variedade de técnicas, como as gotas1,2, Microfluido3, nanogrids4e micropoços5, a maioria dos métodos não pode classificar tipos de células definidas que expressam fluorophores geneticamente codificado. Para isolar uma população selecione a célula, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é frequentemente usada para classificar as pilhas etiquetadas em um modo de célula única. No entanto, FACS tem algumas restrições e requer etapas de processamento de amostra meticuloso. Em primeiro lugar, um grande número de células de entrada é normalmente necessários (muitas vezes vários milhões de células / mL), com uma fração significativa (> 15 – 20%) contendo a população rotulada. Em segundo lugar, preparações da pilha podem exigir várias rodadas de etapas de centrifugação gradiente de densidade para remover fração glia, detritos e aglomerados de células que caso contrário podem obstruir o bocal ou fluxo de célula. Em terceiro lugar, FACS geralmente emprega a coloração e descoloração passos para viver/morrer coloração (por exemplo, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), iodeto de propidium (PI) e corantes Cytotracker), que ocupam tempo adicional. Em quarto lugar, como uma regra de ouro para duas cores classificação (como DAPI e proteína fluorescente verde/vermelho (GFP/RFP)), geralmente duas amostras e um controle são necessários, exigindo uma amostra sem rótulo para ser processado além da estirpe do mouse desejado. Em quinto lugar, a filtragem é frequentemente realizada várias vezes antes e durante a amostra classificação para proativamente evitar linhas de exemplo obstruído em uma máquina de FACS. Em sexto lugar, o tempo deve ser atribuído em configurações de FACS mais comumente usadas para inicializar e estabilizar o fluxo de fluido e realizar a calibração da gota. Sétimo, controle de amostras geralmente são executadas em sequência antes da colheita de amostra real para criar matrizes de compensação, rejeição de gibão, definindo portões, etc. os usuários também executar as etapas 6 e 7 se antes do tempo ou exigir o assistência de um técnico em paralelo. Finalmente, post-FACS, muitas vezes há medidas para assegurar que somente rotulado única células estão presentes em cada poço; por exemplo, verificando as amostras em uma configuração de alto teor de triagem como um gerador de imagens de prato rápido.
Para contornar as etapas descritas acima e facilitar um relativamente rápida, alvo de sequenciamento de uma pequena população de neurônios fluorescente etiquetadas único, descrevemos um manual de classificação procedimento seguido por duas rodadas de um altamente sensíveis em vitro Protocolo de amplificação, chamado dobro da transcrição in vitro com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq). A geração de biblioteca de amplificação e do cDNA de RNA é adaptada de Eberwine et al . 6 e Hashimshony et al . 7, com certas modificações para atender interneurônios rato que têm volumes menores de celulares; Além disso, encontramos também é igualmente útil para excitatórios neurônios piramidais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O manual de classificação protocolo é apropriado para uma sequenciação do ARN supervisionada de neurônio populações que são escassamente rotulada do cérebro de ratos ou estão representando uma população de células raras que caso contrário, não é viável para estudar usando a célula atual da elevado-produção métodos de triagem e amplificação. As células submetidas a FACS geralmente sofrem pressões de linha bainha e amostra na faixa de ~ 9 – 14 psi, dependendo do tamanho do bocal e desejado taxas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH (5R01MH094705-04 e 01-R01MH109665 para Z.J.H.), pelo fundo de neurociência CSHL Robertson (para Z.J.H.) e por um NARSAD Doctoral Fellowship (para A.P.).
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
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