Encellede RNA sekventering af Fluorescently mærket mus neuroner ved hjælp af manuel sortering og dobbelt In Vitro transskription med absolut tæller sekventering (DIVA-Seq)
Summary
Denne protokol beskriver den manuelle sortering procedure for at isolere enkelt fluorescently mærket neuroner efterfulgt af in vitro- transskription-baserede mRNA forstærkning til høj-dybde encellede RNA sekvensering.
Abstract
Encellede RNA sekventering (RNA-FF.) er nu en bredt implementeret værktøj for materialeprøvning genekspression. Kommercielt tilgængelige encellede RNA-sekventering platforme behandle alle inputceller ukritisk. Nogle gange bruges fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) opstrøms at isolere et specifikt mærket befolkning af interesse. En begrænsning af FACS er behovet for høje antal input celler med betydeligt mærket fraktioner, som er upraktisk for indsamling og profilering sjældne eller tyndt mærket neuron befolkninger fra mus hjernen. Her, beskriver vi en metode til manuelt indsamling sparsomme fluorescently mærket enkelt neuroner fra frisk dissocieres mus hjernevæv. Denne proces giver mulighed for opfange single-mærket neuroner med høj renhed og efterfølgende integration med en in vitro- transskription-baseret forstærkning protokol, der bevarer endogene udskrift nøgletal. Vi beskriver en dobbelt lineær forstærkning metode, der bruger unikt molekyle identifikatorer ((UMIS) velkommen) til at generere enkelte mRNA tæller. To runder af forstærkning resulterer i en høj grad af gen påvisning pr. enkelt celle.
Introduction
Encellede RNA sekventering (RNA-seq) har forvandlet transkriptom undersøgelser. Mens store enkelt-celle RNAseq kan udføres ved hjælp af en række teknikker, som dråber1,2, mikrofluidik3, nanogrids4og microwells5, kan ikke de fleste metoder sortere definerede celletyper at udtrykke genetisk kodet fluorophores. For at isolere en Marker celle population, bruges fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) ofte til at sortere mærket celler i en enkelt celle tilstand. FACS har dog nogle begrænsninger og kræver omhyggelig prøve behandlingstrin. Først, et stort antal input celler er typisk behov (ofte flere millioner celler pr. mL), med en betydelig brøkdel (> 15 – 20%) der indeholder mærket befolkningen. For det andet kan celle præparater kræve flere runder af tæthed gradient centrifugering skridt til at fjerne glial brøkdel, snavs og celle klumper, der ellers kan tilstoppe cellen dyse eller flow. For det tredje beskæftiger FACS normalt farvning og affarvning trin for live/døde farvning (fx 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium Iodid (PI) og Cytotracker farvestoffer), som tager op ekstra tid. Fjerde, som en tommelfingerregel for to-farve sortering (f.eks DAPI og grøn/rød fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis/RFP)), normalt to prøver og en kontrol er nødvendig, kræver en umærket prøven skal behandles ud over den ønskede mus stamme. For det femte er filtrering ofte udføres flere gange før og under prøven sortering for at proaktivt forhindre tilstoppede prøve linjer i en FACS maskine. Det sjette skal gang tildeles i mest almindeligt anvendte FACS opsætninger til at initialisere og stabilisere den flydende strøm og udføre droplet kalibrering. Syvende, kontrol prøver der typisk køres i rækkefølge før den faktiske prøvetagning til nedsat erstatning matricer, doublet afvisning, indstilling gates, etc. brugere enten udføre trin seks og syv selv god tid eller kræver det hjælp fra en tekniker parallelt. Endelig, post-FACS, der er ofte skridt til at sikre, at kun mærket enkelt celler er til stede i hver brønd; for eksempel, ved at kontrollere prøver i en høj-indhold screening Opsætning såsom en fast plade imager.
For at omgå trinene ovenfor og lette en forholdsvis hurtig, målrettet sekventering af en lille population af enkelt fluorescently mærket neuroner, beskriver vi en manuel sortering procedure efterfulgt af to runder af en yderst følsom in vitro forstærkning protokol, kaldet dobbelt in vitro transskription med absolut tæller sekventering (DIVA-Seq). RNA forstærkning og cDNA bibliotek generation er tilpasset fra Eberwine et al. 6 og Hashimshony et al. 7, med visse ændringer der passer til mus interneurons, der har mindre cellulære mængder; Derudover har vi også fundet, at det er lige så nyttige for excitatoriske pyramideformet neuroner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den manuelle sortering protokol er velegnet til en overvåget RNA sekventering af neuron befolkningsgrupper, som er enten sparsomt mærket i hjernen, mus eller repræsenterer en sjælden celle befolkning, som ellers ikke er muligt at studere ved hjælp af aktuelle høj overførselshastighed celle sortering og forstærkning metoder. Celler udsat for FACS normalt gennemgå kappe og prøve linje pres i rækken af ~ 9-14 psi, afhængigt af dyse størrelse og ønskede begivenhed priser. Derudover ved at blive skubbet ud fra d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (5R01MH094705-04 og R01MH109665-01-Z.J.H.), CSHL Robertson neurovidenskab fond (til Z.J.H.) og en NARSAD Post-Doctoral Fellowship (til A.P.).
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
- Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
- Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
- Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
- Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
- Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
- Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
- Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
