Single-cell RNA-sekvensering av Fluorescently märkt mus nervceller med manuell sortering och dubbel In Vitro transkription med absolut räknas sekvensering (DIVA-Seq)
Summary
Det här protokollet beskriver manuell sortering procedur för att isolera enstaka fluorescently märkt nervceller följt av in vitro- transkription-baserade mRNA förstärkning för hög-djup encelliga RNA-sekvensering.
Abstract
Encelliga RNA-sekvensering (RNA-seq) är nu ett allmänt genomförda verktyg för testmetoder genuttryck. Kommersiellt tillgängliga encelliga RNA-sekvensering plattformar bearbeta alla indataceller urskillningslöst. Fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) används ibland, uppströms att isolera en specifikt märkt population av intresse. En begränsning av FACS är behovet stort antal indataceller med betydligt märkt fraktioner, som är opraktiskt för insamling och profilering sällsynta eller glest märkt neuron populationer från mus hjärnan. Här, beskriver vi en metod för manuellt samla glesa fluorescently märkt enda nervceller från färska dissocierade mus hjärnvävnad. Denna process möjliggör fånga singel-märkt nervceller med hög renhet och efterföljande integration med ett in vitro- transkription-baserade förstärkning protokoll som bevarar endogena avskrift nyckeltal. Vi beskriver en dubbel linjär förstärkning metod som använder identifierare för unik molekyl (UMIs) för att generera individuella mRNA räknas. Två omgångar av förstärkning resulterar i en hög grad av gen upptäckt per enskild cell.
Introduction
Encelliga RNA-sekvensering (RNA-seq) har förändrat transcriptomic studier. Medan storskaliga encelliga RNAseq kan utföras med hjälp av olika tekniker, såsom droppar1,2, mikrofluidik3, nanogrids4och mikrobrunnar5, kan inte de flesta metoder sortera definierade celltyper som express genetiskt kodade fluorophores. För att isolera en Markera cell befolkningen, används fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) ofta för att sortera märkta celler i en enskild cell-läge. Dock FACS har vissa begränsningar och kräver noggranna prov bearbetningssteg. Först, ett stort antal indataceller är vanligtvis behövs (ofta flera miljoner celler per mL), med en betydande fraktion (> 15 – 20%) som innehåller märkt befolkningen. Det andra kan cell preparat kräva flera rundor av täthet lutning centrifugering steg ta bort gliaceller bråkdel, skräp och cell klumpar som kanske annars täpper till munstycke eller flöde cellen. För det tredje, FACS vanligtvis sysselsätter färgning och avfärgning steg för live/dead färgning (t.ex. 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI), propidium jodid (PI) och Cytotracker färgämnen), vilket tar ytterligare tid. För det fjärde, som en tumregel för två-färg sortering (såsom DAPI och grön/röd fluorescerande protein (GFP/RFP)), vanligtvis två prov och en kontroll behövs, som kräver en omärkt prov ska behandlas förutom önskad mus stammen. Det femte utförs filtrering ofta flera gånger före och under prov sortering för att proaktivt förhindra tilltäppta prov rader i en FACS maskin. Det sjätte måste tid tilldelas i vanligaste FACS uppställningar att initiera och stabilisera den flytande strömmen och utföra droplet kalibrering. Sjunde, kontroll prover vanligtvis körs i ordning innan den faktiska provtagning att ställa in kompensation matriser, doublet avvisande, grindar, etc. användare antingen Utför steg sex och sju sig före tid eller kräver den assistans av en tekniker parallellt. Slutligen, post-FACS, finns det ofta åtgärder för att säkerställa att endast märkt enstaka celler är närvarande i varje brunn; exempelvis genom att kontrollera prover i en hög-innehåll screening setup såsom en snabb platta imager.
För att kringgå de steg som beskrivs ovan och underlätta en relativt snabb, riktade sekvensering av en liten befolkning av enstaka fluorescently märkt nervceller, beskriver vi en manuell sortering procedur följt av två rundor av en mycket känsliga in vitro förstärkning protocol, kallad dubbel in vitro-transkription med absolut räknas sekvensering (DIVA-Seq). Den RNA amplifiering och cDNA bibliotek generationen är anpassade från Eberwine et al. 6 och Hashimshony o.a. 7, med vissa ändringar som passar musen interneuroner som har mindre cellulära volymer; Dessutom har vi också funnit att det är lika användbara för excitatoriska pyramidal nervceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Manuell sortering protokoll är lämplig för en övervakad RNA-sekvensering av neuron populationer som antingen glest märkt i möss hjärnan eller företräder en ovanlig cell befolkning som inte annars är möjligt att studera med hjälp av aktuella hög genomströmning cellen sortering och förstärkning metoder. Celler utsätts för FACS vanligtvis genomgå slida och prov linje påtryckningar i spänna av ~ 9 – 14 psi, beroende på munstycke och önskad händelse priser. Dessutom på att matas ut från munstycket …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd genom bidrag från NIH (5R01MH094705-04 och R01MH109665-01-Z.J.H.), av CSHL Robertson neurovetenskap fonden (till Z.J.H.) och av en publicerade Post-Doctoral Fellowship (att A.P.).
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
- Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
- Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
- Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
- Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
- Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
- Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
- Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
