Motifs d’ADN stable, 1D et 2D Nanostructures construit à partir de molécules d’ADN circulaire petit

Summary

Cet article présente un protocole détaillé pour ligature de T4 et de la dénaturation PAGE purification de petites molécules d’ADN circulaires, recuit et gel natif analyse de pages de tuiles circulaires, le montage et l’imagerie AFM de nanostructures ADN 1D et 2D, ainsi que d’agarose électrophorèse et centrifugation purification des nanostructures d’ADN finie.

Abstract

Cet article présente un protocole détaillé pour la synthèse de petites molécules d’ADN circulaires, recuit de motifs d’ADN circulaire et la construction de nanostructures ADN 1D et 2D. Au cours des dernières décennies, l’essor des nanotechnologies ADN est attribuée à l’utilisation d’ADN linéaire comme les matériaux de source. Par exemple, la tuile DAO (double crossover, demi-tours antiparallèles, impaires) est bien connue comme un bloc de construction pour la construction de grilles d’ADN 2D ; la structure de base du DAO est issue de deux oligonucléotides monocaténaire linéaire (ss), comme deux cordes en faisant un nœud de granny main droite. Dans les présentes, un nouveau type de tuiles d’ADN appelé Badc (couplé DAO) sont construites en utilisant un petit ss-ADN circulaire de c64nt ou c84nt (circulaires 64 ou 84 nucléotides) comme le brin d’échafaudage et de plusieurs ss-DNAs linéaire comme les brins discontinues. Parfait nanostructures 1D et 2D sont assemblés à partir de Badc tuiles : nanofils infinie, nanospirals, nanotubes, nanorubans ; et finis nano-rectangles. Des protocoles détaillés sont décrites : préparation 1) par ligase T4 et purification par dénaturation PAGE (sur gel de polyacrylamide) des petits oligonucléotides circulaires, 2) recuit de tuiles circulaires stables, suivie de native analyse de PAGE, 3) assemblage de nanofils de 1D infinie, nanorings, nanospirals, infinies treillis 2D de nanotubes et nanorubans et finis 2D nano-rectangles, suivie d’imagerie de l’AFM (Atomic Force Microscopy). La méthode est simple, robuste et abordable pour la plupart des laboratoires.

Introduction

Molécules d’ADN ont été utilisés pour construire beaucoup de genres de nanostructures au cours des dernières décennies. Des motifs typiques incluent DAE (double croisé, antiparallèles, même demi-tours) et DAO carreaux^1,2,3, tuiles étoiles^4,5,6,7, simples Stranded (ss) carreaux^8,9,10et ADN origami^11,12,13. Ces motifs de l’ADN et les grilles sont assemblés à partir de ss-DNAs linéaire. Récemment, d’autres et nous avons rapporté l’utilisation de circulaires ss-oligonucléotides comme échafaudages pour construire des motifs, nanotubes 1D et 2D grilles^14,15,16,17. En insérant un Holliday junction (HJ)^18,19,20,21 au centre de c64nt, une paire de deux carreaux DAO couplés peut être formé¹⁷. Ce nouveau motif Badc et ses dérivés sont stables et suffisamment rigide pour assembler 2D ADN grilles jusqu’à 3 × 5 µm². Dans cet article, nous utilisons un terme de « dalle circulaire », qui est définie comme une molécule stable de complexes ADN construite avec un échafaudage circulaire et autres agrafes linéaires des ss-oligonucléotides, et un nouveau mandat de « carreau linéaire », qui est construit à partir d’un ensemble complet de linéaire SS-oligonucléotides.

Ce protocole montre comment construire cinq sortes de nanostructures d’ADN avec des petites molécules d’ADN circulaires comme les échafaudages : 1) infinie nanofils de c64nt et c84nt de 1D, 2D Badc-c64nt-O 2) infinie et Badc-c64nt-E (-O représente un nombre impair de 5 demi-tours et-e représente un nombre pair de 4 demi-tours) grilles, 3) infinies 2D Badc-c84nt-O et Badc-c84nt-E grilles, 4) finis 2D 5 × 6 Badc-c64nt-O et les rectangles de Badc-c74 & 84nt-O 5 × 6, 5) infinie 1D acDAO-c64nt-E nanorings et nanospirals (Veuillez vous reporter à Figure 3-5 pour les schémas et images des cinq sortes de nanostructures ADN ci-dessus). Les nanofils de 1D c64nt et c84nt sont assemblés à partir de chaque échafaudage c64nt et c84nt associé respectivement avec deux agrafes linéaires. Chaque tuile circulaire de Badc-c64nt, acDAO-c64nt, Badc-c74nt ou c84nt-Badc est recuit de son échafaudage correspondant de c64nt, c74nt ou c84nt avec quatre agrafes linéaires respectivement. Les treillis 2D infinies sont assemblés à partir du même type de deux tuiles circulaires avec différentes séquences. Les deux grilles rectangle 2D finis sont assemblés de deux ensembles de tuiles sous circulaires 32 respectivement. Pour économiser de l’argent, c84nt, c74nt et c64nt seulement un séquencée est utilisé comme l’échafaud respectif tandis que différents porte-à-faux servent de recuire les 32 Badc-c64nt Badc-c74nt 12 et 20 Badc-c84nt circulaire sous tuiles respectivement dans la première étape de recuit sous tuile, puis mélanger 32 tuiles sous circulaires correspondantes et appliquer le deuxième treillis recuit étape visant à regrouper le finis 5 × 6 Badc-c64nt-O et 5 × 6 grilles Badc-c74 & 84nt-O, respectivement. Certainement, séquencés différemment des échafaudages circulaires peuvent être adoptées pour assembler une variété de nanostructures de taille finie, mais il vous en coûtera plus d’argent et labeurs. L’infini 1D acDAO-c64nt-E nanorings et nanospirals sont recuits de celui-séquencé asymétrique acDAO-c64nt tuiles avec des connexions linéaires d’un nombre pair de 4 demi-tours. Il existe deux approches pour assembler des grilles 2D infinies de tuiles circulaires de Badc-c64nt et Badc-c84nt, qui se distinguent par les distances mezhizraztsovye d’un nombre pair de 4 et un nombre impair de 5 demi-tours respectivement. Le premier exige que tous les carreaux doivent être alignés de manière identique ; cette dernière nécessite l’alternance des visages de deux tuiles voisines le long des axes hélicoïdes. Si la tuile est rigide et plane, comme Badc-c64nt, les deux approches générera nanorubans planaire ; Si la tuile est courbée vers une seule direction, tels que Badc-c84nt, la mezhizraztsovye connexion d’un nombre pair de 4 demi tours vont générer des nanotubes, tandis que la connexion mezhizraztsovye d’un nombre impair de 5 demi tours produira planaire nanorubans due à l’élimination des influencé par courbure de croissance par l’autre alignement des tuiles. Le succès de l’Assemblée des nanostructures d’ADN 1D et 2D de tuiles circulaires indique plusieurs avantages de cette nouvelle approche : forcée de stabilité et de rigidité des tuiles circulaires sur les carrelages linéaires, chiral carreaux pour l’assemblage des nanostructures asymétrique tels que nanorings et nanorubans, nouvelles visions sur la compréhension de la mécanique de l’ADN et les structures moléculaires, les etc..

Protocol

1. préparation d’ADN circulaire Utilisez tous les ADN linéaire fourni par les sociétés commerciales directement, sans davantage de purification. Centrifuger les échantillons d’ADN à 5 000 × g pendant 5 min recueillir toutes les pastilles d’ADN au fond des tubes. Ajouter un volume suffisant de tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) pour dissoudre l’ADN. Mesurer la concentration de « a » ng/µL de chaque solution de ss-ADN à l’aide d’un spectromètre UV micro à 260 …

Representative Results

L’ADN circulaire se déplace légèrement plus lent que son ADN linéaire de précurseur en dénaturant PAGE (Figure 2) parce que le pore à l’intérieur de l’ADN circulaire est pénétré et retardé par gel fibres23,24,25. L’efficacité de réaction de ligature correcte de cyclisation de l’oligo-monomère dépend de la séquence de substrat et concentrati…

Discussion

Les protocoles présentés en ce bref article sur la synthèse de petites molécules d’ADN circulaires et l’Assemblée des nanostructures de l’ADN. La plupart des modèles d’ADN séquencée au hasard peut être utilisée dans le présent protocole. La pureté de l’ADN circulaire est critique pour le succès des assemblées de l’ADN. Le rendement de production de cyclisation peut être amélioré en réduisant la concentration de l’ADN linéaire 5′-phosphorylés ; Toutefois, cela augmentera la charge de tra…

Materials

T4 ligase	TaKaRa	2011A
T4 buffer	TaKaRa	2011A
TE buffer	Sangon	B548106
Thermo bottle	Thermos	SK-3000
Thermo cycler	Bio Gener	GE4852T
Exonuclease I	TaKaRa	2650A
Exonuclease I buffer	TaKaRa	2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1)	Sangon	B546016
TAE premix podwer	Sangon	B540023
Mg(Ac)2·4H2O	Nanjing Chemical Reagent	C0190550223
Urea	Sangon	A510907
TEMED	BBI	A100761
Ammonium Persulfate	Nanjing Chemical Reagent	13041920295
Power supply	Beijing Liuyi	DYY-8C
Water bath	Sumsung	DK-S12
Formamide	BBI	A100314
DNA Marker (25~500 bp)	Sangon	B600303
DNA Marker (100~3000 bp)	Sangon	B500347
Loading buffer	Sangon	B548313
PAGE electrophoresis systerm	Beijing Liuyi	24DN
Filter	ASD	5010-2225	0.22 µM
UV imaging System	Tanon	2500R
n-butanol	Sangon	A501800
Absolute Ethanol	SCR	10009257
NaOAc	Nanjing Chemical Reagent	12032610459
Centrifuge	eppendorf	Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator	CHRIST	RVC 2-18
Ultraviolet spectrum	Allsheng	Nano-100
nucleic acid stain	Biotium	16G1010	GelRed
Agarose	Biowest	G-10
Agarose electrophoresis systerm	Beijing Liuyi	DYCP-31CN
Heating Plate	Jiangsu Jintan	DB-1
TBE premix podwer	Sangon	B540024
filter column	Bio-Rad	7326165	Freeze 'N Squeeze column
AFM	Bruker	Dimension FastScan
PEG8000	BBI	A100159
Mica	Ted Pella	BP50
triangular AFM probe in air	Bruker	FastScan-C
triangular AFM probe in fulid	Bruker	ScanAsyst-fluid+
DNA strands	Sangon