زخارف الحمض النووي مستقرة، 1 د والنانو 2D شيدت من جزيئات الحمض النووي دائرية صغيرة
Summary
تعرض هذه المقالة بروتوكول مفصل لربط T4 ويشوه تنقية صفحة صغيرة من جزيئات الحامض النووي المعاد، الصلب وتحليل الصفحة الأصلية البلاط دائرية، وتجميع وتصوير فؤاد النانو الحمض النووي 1 د و 2D، فضلا عن [اغروس] هلام تنقية النانو الحمض النووي المحدود التفريد والطرد المركزي.
Abstract
تعرض هذه المقالة بروتوكول مفصل لتوليف جزيئات الحمض النووي دائرية صغيرة، الصلب الدائرية زخارف الحمض النووي، وتشييد النانو الحمض النووي 1 د و 2D. على مدى عقود، والتطور السريع لتكنولوجيا النانو الحمض النووي يعزى إلى استخدام خطي من السلطات الوطنية المعينة كمواد المصدر. على سبيل المثال، بلاط DAO (مزدوجة كروس، ويتحول نصف أنتيباراليل، والغريب) المعروف جيدا كلبنة للبناء في 2D المشابك الحمض النووي؛ بنية أساسية من DAO يتكون من اثنين النوكليوتيد خطية واحدة-الذين تقطعت بهم السبل (ss)، مثل الحبال اثنين جعل عقده جدة يد اليمنى. هنا، نوع جديد من البلاط الحمض النووي يسمى كداو (إلى جانب DAO) تم إنشاؤها باستخدام ss دائرية صغيرة-الحمض النووي c64nt أو c84nt (التعميم النيوكليوتيدات 64 أو 84) حبلا سقالة وعده ss الخطي-السلطات الوطنية المعينة كخيوط التيلة. يتم تجميعها النانو 1 د و 2D المثالي من البلاط كداو: أسلاك لانهائية، نانوسبيرالس، والأنابيب النانوية، نانوريبونس؛ ومستطيلات نانو المحدودة. يتم وصف بروتوكولات مفصلة: 1) إعداد ليجاسى T4 وتنقية من يشوه الصفحة (polyacrylamide هلام التفريد) من النوكليوتيد دائرية صغيرة، 2) الصلب من البلاط دائرية مستقرة، متبوعاً بتحليل الصفحة الأصلية، 3) تجميع لانهائي 1 مد أسلاك، نانورينجس، نانوسبيرالس، المشابك 2D لانهائية من الأنابيب النانوية، ونانوريبونس، ونانو 2D المحدودة-مستطيلات، متبوعاً بتصوير فؤاد (مجهر القوة الذرية). الطريقة بسيطة وقوية وفي متناول معظم المعامل.
Introduction
وقد استخدمت جزيئات الحمض النووي لبناء العديد من أنواع النانو على مدى عقود. زخارف نموذجية تشمل داي (كروس مزدوجة، أنتيباراليل، حتى النصف-يتحول) DAO البلاط1،2،3، البلاط نجمة4،5،،من67، واحد تقطعت بهم السبل (ss) البلاط8،،من910، والحمض النووي أوريغامي11،،من1213. ويتم تجميع هذه الزخارف الحمض النووي والأسوار من خطي ss-السلطات الوطنية المعينة. في الآونة الأخيرة، أفادت الآخرين ونحن استخدام النوكليوتيد ss التعميم كسقالات بناء زخارف ومد 1 الأنابيب النانوية، والمشابك 2D14،15،،من1617. عن طريق إدراج هوليداي مفرق (هجرية)18،19،،من2021 في مركز c64nt، يمكن أن يكون زوج من جانب اثنين من البلاط DAO شكلت17. هذه فكرة كداو الجديدة ومشتقاته مستقرة وجامدة ما يكفي لتجميع 2D الحمض النووي الأسوار يصل إلى 3 × 5 ميكرومتر2. في هذه الورقة، ونحن نستخدم مصطلح “بلاط التعميم”، التي تعرف بأنها مستقرة معقدة جزيء الحمض النووي التي شيدت سقالة دائرية واحدة وأخرى دبابيس الخطي من النوكليوتيد ss، وفترة أخرى من “بلاط الخطي”، التي تم إنشاؤها من مجموعة كاملة من الخطي س-النوكليوتيد.
هذا البروتوكول يوضح كيفية بناء خمسة أنواع من الحمض النووي النانو مع جزيئات الحمض النووي دائرية صغيرة السقالات: 1) لا حصر له من أسلاك c64nt و c84nt د 1، 2) لانهائية 2D كداو-c64nt-س وكداو-c64nt-E (-س يمثل عدد فردي 5 يتحول النصف و-E تمثل عدد زوجي من نصف 4-يتحول) الأسوار، 3) لانهائية 2D كداو-c84nt-س وكداو-c84nt-ه المشابك، 4) محدودة 2D 5 × 6 كداو-c64nt-س و 5 × 6 كداو-c74 & 84nt-O مستطيلات، 5) لانهائية نانورينجس أكداو-c64nt-ه د 1 ونانوسبيرالس (يرجى الرجوع إلى 3 الرقم-5 لرسومات تخطيطية وصور لأنواع النانو الحمض النووي الخمسة المذكورة أعلاه). يتم تجميع أسلاك c64nt و c84nt د 1 من كل سقالة c64nt و c84nt المقترنة دبوسان الخطي على التوالي. هو تعتيق كل بلاطة دائرية كداو-c64nt، أكداو-c64nt، c74nt كداو، أو كداو-c84nt من على سقالة المقابلة c64nt أو c74nt أو c84nt بأربعة دبابيس الخطي على التوالي. يتم تجميع المشابك 2D لانهائية من نفس النوع من اثنين من البلاط التعميم مع تسلسلات مختلفة. يتم تجميعها المشابك المستطيل 2D المحدودة اثنين من مجموعتين من البلاط الفرعية التعميم 32 على التوالي. لتوفير المال، التسلسل واحد فقط c64nt، و c74nt، و c84nt سقالة كل منهما بينما يتدلى مختلفة تستخدم يصلب 32 كداو-c64nt، c74nt كداو 12، والبلاط الفرعية التعميم c84nt كداو 20 على التوالي في الخطوة انلينغ بلاط الفرعية الأولى، ثم مزيج البلاط الفرعية التعميم 32 مقابلة معا وتطبيق الثانية شعرية الصلب خطوة لتجميع محدودة 5 × 6 كداو-c64nt-س و 5 × 6 كداو-c74 & 84nt-O المشابك، على التوالي. بالتأكيد، يمكن اعتماد السقالات دائرية متتابعة بشكل مختلف لتجميع مجموعة متنوعة من النانو محدودة الحجم، لكن سوف يكلف المزيد من المال والعمال. هي تعتيق نانورينجس أكداو-c64nt-ه د 1 لانهائية ونانوسبيرالس من البلاط التسلسل واحد غير المتناظر أكداو-c64nt مع اتصالات خطية من عدد زوجي من نصف 4-يتحول. هناك طريقتان لتجميع المشابك 2D لانهائية من البلاط التعميم كداو-c64nt وكداو-c84nt، والتي تتميز بالمسافات إينتيرتيلي من عدد زوجي من 4 وعدد فردي من النصف-يتحول 5 على التوالي. السابق يتطلب كافة المربعات محاذاة مماثل؛ الأخير يتطلب تناوب وجوه اثنين من البلاط المجاورة على طول محاور حلزونية. إذا كان الإطار المتجانب جامدة ومستو، مثل c64nt كداو، كلا النهجين سيولد نانوريبونس مستو؛ إذا البلاطة منحنى نحو اتجاه واحد، مثل كداو-c84nt، الاتصال إينتيرتيلي من عدد زوجي من 4 يتحول نصف سيولد الأنابيب النانوية، بينما الاتصال إينتيرتيلي من عدد فردي من 5 سوف تنتج يتحول نصف مستو نانوريبونس نظراً للقضاء على المنحازة لانحناء النمو بمحاذاة بديل للبلاط منحنية. جمعية ناجحة 1 د و 2D النانو الحمض النووي من البلاط التعميم يشير إلى العديد من المزايا لهذا النهج الجديد: فرض الاستقرار وصلابة البلاط التعميم على خطي البلاط، والبلاط مراوان لجمعية النانو غير متماثلة مثل نانورينجس ونانوريبونس، رؤى جديدة في فهم الميكانيكا الحمض النووي والهياكل الجزيئية، إلخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكولات المقدمة في هذه المادة التركيز على تجميع جزيئات الحمض النووي دائرية صغيرة والجمعية للنانو الحمض النووي. يمكن استخدام معظم التصاميم الحمض النووي التسلسل عشوائياً في هذا البروتوكول. نقاء المعينة التعميم أمر حاسم لنجاح التجميعات الحمض النووي. ويمكن تحسين غلة الإنتاج سيكليزاتي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للدعم المالي من تشرف (منح رقم 91753134 و 21571100)، ومفتاح المختبر من بيوليكترونيكس من جنوب شرق جامعة الدولة.
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
References
- Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
- Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
- Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
- Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
- Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
- Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
- Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
- Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
- Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
- Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
- Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1 (1), 157-181 (1990).
- Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
- Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
- Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579 (1985).
- Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).
