Motivos de ADN estable, 1D y 2D nanoestructuras construyen a partir de moléculas de ADN Circular pequeño
Summary
Este artículo presenta un protocolo detallado para ligadura de T4 y desnaturalización página purificación de moléculas pequeñas de ADN circular, recocido y del análisis de la página nativa de Tejas circular, montaje y proyección de imagen de AFM de nanoestructuras de ADN de 1D y 2D, así como de agarosa gel purificación de electroforesis y centrifugación de nanoestructuras de ADN finito.
Abstract
Este artículo presenta un protocolo detallado para la síntesis de pequeñas moléculas de ADN circular, recocido de circular motivos de ADN y la construcción de nanoestructuras de ADN de 1D y 2D. Durante décadas, el rápido desarrollo de la nanotecnología de ADN se atribuye al uso de DNAs lineales como los materiales. Por ejemplo, el azulejo DAO (doble cruce, antiparalelos, impares de medias vueltas) es conocido como un bloque de construcción para la construcción de enrejados de ADN 2D; la estructura base del DAO se hace de dos oligonucleótidos lineal monocatenario (ss), como dos cuerdas haciendo un nudo de la abuelita de mano derecha. Aquí, un nuevo tipo de azulejos de ADN llamado cDAO (DAO acoplado) se construyen utilizando una pequeño ss-DNA circular de c64nt o c84nt (circular 64 o 84 nucleótidos) como el filamento de andamio y varios ss-DNAs lineales como las hebras discontinuas. Perfectos Nanoestructuras 1D y 2D son ensamblados de azulejos cDAO: infinito nanohilos, nanotubos, nanospirals, nanoribbons; y nano-rectángulos finitos. Protocolos detallados se describen: 1) preparación por T4 ligasa y purificación desnaturalizando PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) de oligonucleótidos circular pequeño, 2) recocido de Tejas circular estables, seguido por análisis de la página nativa, montaje de 3) de infinito 1D nanohilos, Nanoanillos, nanospirals, infinitos 2D enrejados de nanotubos y nanoribbons nano-rectángulos finitos de 2D, seguido de proyección de imagen de AFM (microscopía de fuerza atómica). El método es simple, robusto y asequible para la mayoría de laboratorios.
Introduction
Las moléculas de ADN se han utilizado para construir muchos tipos de nanoestructuras en décadas. Motivos típicos incluyen DAE (doble cruce, antiparalela, incluso medias vueltas) y DAO azulejos1,2,3, azulejos estrellas4,5,6,7, trenzado (ss) azulejos8,9,10y ADN origami11,12,13. Estos motivos de ADN y los enrejados están montados de ss-DNAs lineales. Recientemente, otros ya hemos divulgado el uso de oligonucleótidos de ss circular como andamios para construir motivos, nanotubos de 1D y 2D enrejados14,15,16,17. Insertando un Holliday junction (HJ)18,19,20,21 en el centro de c64nt, un par de dos azulejos DAO acoplados puede ser formado17. Este nuevo motivo cDAO y sus derivados son estables y lo suficientemente rígido para montar 2D ADN enrejados hasta 3 × 5 μm2. En este trabajo, utilizamos un término de “mosaico circular”, que se define como una estable molécula compleja de DNA construida con un andamio circular y otras grapas lineales de oligonucleótidos de ss, y otro término de “mosaico lineal”, que se construye a partir de un conjunto completo de lineal SS-oligonucleótidos.
Este protocolo muestra cómo crear cinco tipos de nanoestructuras de ADN con pequeñas moléculas circulares de ADN como andamios: 1) infinita nanohilos de c64nt y c84nt D 1, 2) infinito 2D cDAO-c64nt-O y cDAO-c64nt-E (-O representa un número impar de 5 medias vueltas y -E representa un número par de 4 medias vueltas) enrejados, 3) infinitos 2D cDAO-c84nt-O y cDAO-c84nt-E enrejados, 4) finito 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O y 5 × 6, rectángulos cDAO-c74 & 84nt-O, 5) infinito 1D Nanoanillos de acDAO-c64nt-E y nanospirals (refiera por favor a Figura 3-5 para los dibujos esquemáticos y las imágenes de los anteriores cinco tipos de nanoestructuras de ADN). El 1D c64nt y c84nt los nanohilos se ensamblan desde cada andamio c64nt y c84nt asociado con dos grapas lineales respectivamente. Cada loseta circular de cDAO-c64nt, c64nt de acDAO, cDAO-c74nt o cDAO-c84nt es templado de su andamio correspondiente de c64nt, c74nt o c84nt con cuatro grapas lineales respectivamente. Los enrejados 2D infinitos se montan con el mismo tipo de dos fichas circulares con diferentes secuencias. Los dos enrejados de rectángulo 2D finito se montan de dos conjuntos de sub-fichas circular 32 respectivamente. Para ahorrar dinero, c84nt, c74nt y c64nt sólo una-secuencia se utiliza como el andamio respectivo y diferentes voladizos se recuece el 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt y circular baldosas sub 20 cDAO-c84nt respectivamente en el primer paso del recocido de las baldosas, luego mezclar las sub-fichas circular 32 correspondientes y aplicar el segundo enrejado recocido paso para montar el cDAO de finitas 5 × 6-c64nt-O y 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O enrejados, respectivamente. Definitivamente, andamios circulares ordenados de manera diferente pueden ser adoptados para montar una variedad de nanoestructuras de tamaño finito, sin embargo costará más dinero y trabajos. El infinito 1D acDAO-c64nt-E Nanoanillos y nanospirals son recocido de Tejas una secuencia asimétrica acDAO-c64nt con conexiones lineales de un número par de 4 medias vueltas. Existen dos enfoques para armar enrejados 2D infinitos de azulejos circulares de cDAO-c64nt y cDAO-c84nt, que se distinguen por las distancias intertile de un número par de 4 y un número impar de 5 medias vueltas respectivamente. El primero requiere que todas las fichas para ser alineados idénticamente; Este último requiere alternancia de las caras de dos fichas vecinas a lo largo de los ejes helicoidales. Si el azulejo es rígido y planar, como cDAO-c64nt, ambos enfoques generará nanoribbons planar; Si la teja es curva hacia una dirección, como cDAO-c84nt, la conexión intertile de un número par de 4 vueltas media generará nanotubos, mientras que la conexión intertile de un número impar de 5 vueltas media producirá nanoribbons planar debido a la eliminación de crecimiento sesgado de curvatura por alineación alterna de teja curva. La exitosa asamblea de nanoestructuras de ADN de 1D y 2D de azulejos circular indica varias ventajas de este nuevo enfoque: forzada estabilidad y rigidez de circular azulejos sobre azulejos lineales, azulejos quirales para montaje de nanoestructuras asimétrico como Nanoanillos y nanoribbons, nuevas visiones en la comprensión de la mecánica de ADN y las estructuras moleculares, etcetera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos presentados en este enfoque del artículo de la síntesis de pequeñas moléculas de ADN circular y la Asamblea de nanoestructuras de ADN. La mayor parte de diseños de ADN ordenados al azar puede utilizarse en el presente Protocolo. La pureza de los DNAs circulares es crítica para el éxito de los conjuntos de ADN. El rendimiento de producción de ciclación puede mejorarse reduciendo la concentración de ADN lineal 5′-fosforilados; sin embargo, esto aumentará la carga de trabajo para producir la misma …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos por el apoyo financiero de la NSFC (Nº de becas 91753134 y 21571100) y la Universidad Estatal de clave laboratorio de Bioelectrónica del sureste.
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
References
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