ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D
Summary
本稿では T4 結紮およびアニール小さな環状 dna の変性のページ浄化のための詳しいプロトコルとゲルの円形タイル、組立およびアガロースと同様、1 D および 2 D の DNA ナノ構造の原子間力顕微鏡イメージングのネイティブのページの分析有限の DNA ナノ構造の電気泳動および遠心分離浄化。
Abstract
本稿では小さな円形の DNA の分子の合成のための詳しいプロトコル円形の DNA モチーフと 1 D および 2 D の DNA ナノ構造の構築の熱処理します。わたり、DNA のナノテクノロジーの急速な発展はソース材料として線形 DNAs の使用に起因します。たとえば、DAO (クロス オーバー、平行、奇妙な回転半二重) タイルは 2次元 DNA 格子; の建設のためのビルディング ブロックとしてよく知られています。DAO のコア構造は、右手の縦結びを作る 2 つのロープのような 2 つの線形単一座礁させた (ss) オリゴヌクレオチドから作られます。ここ、cDAO (結合 DAO) と呼ばれる DNA タイルの新しい型は、c64nt または c84nt の小さな円形 ss DNA を使用して構築されます (円形 64 または 84 ヌクレオチド) 足場鎖および短鎖としていくつか線形 ss DNAs として。完璧な 1 D および 2 D ナノ構造は cDAO タイルから組み立てられて: 無限ナノワイヤー, nanospirals, カーボンナノ チューブ, ナノリボン;有限のナノ-四角形。詳細なプロトコル説明: 1) 準備 T4 リガーゼと小さな円形のオリゴヌクレオチドのページ (ポリアクリルアミドゲル電気泳動) の変化によって浄化、ネイティブ ページ分析、3) 組立が続く 2) 安定した円形タイルの焼鈍無限 1 次元ナノワイヤ、ナノリングの nanospirals、カーボンナノ チューブ ・ ナノリボン、有限 2次元ナノ-長方形の無限の 2次元格子は AFM (原子間力顕微鏡) 画像が続きます。メソッドは、シンプルで堅牢、かつほとんどのラボの手頃な価格です。
Introduction
DNA 分子は、十年にわたって多くの種類のナノ構造を構築する使用されています。典型的なモチーフは、DAE を含める (平行、ダブルのクロス オーバーも半分-ターン) と 1 つの DAO タイル1,2,3、星のタイル4,5,6、7、(ss) タイル8,9,10、および DNA 折り紙11,12,13を足止め。これらの DNA モチーフと格子は、線形 ss Dna からアセンブルされます。最近では、他の人と我々 は、モチーフと 1 D 2 D 格子14,15,16,17を構築する足場として円形 ss オリゴヌクレオチドの使用を報告しています。C64nt の中心にホリデー ジャンクション (HJ)18,19,20,21を挿入する、2 つの結合 DAO タイルのペアの形成された17できます。この新しい cDAO モチーフとその誘導体は、安定している、2 D を組み立てる十分な剛性 DNA 格子まで 3 × 5 μ m2。本稿で我々 は任期は 1 つの円形の足場や他の線形 ss オリゴヌクレオチドの構築安定した DNA 複合体分子として定義している「円形タイル」と「線形タイル」は、線形の完全なセットから構築の別の用語を使用してss オリゴヌクレオチド。
このプロトコルは、5 種類の足場として小さな環状 dna と DNA ナノ構造を構築する方法を示します: 1) 無限 1 次元 c64nt と c84nt ナノワイヤー、2) 無限の 2D cDAO-c64nt-O および cDAO c64nt E (-O 5 回転半と -E の数が奇数を表します4 回転半の偶数を表します) 格子、3) 無限 4 を cDAO-c84nt-O と cDAO c84nt E 格子を 2次元) 有限 2次元 5 × 6 cDAO-c64nt-O、5 × 6 84nt &o cDAO c74 四角、5) 無限 1 次元 acDAO-c64nt-E ナノリングと nanospirals (を参照してください図 3-5図と DNA ナノ構造体の上記 5 種類の画像)。1 D c64nt と c84nt ナノワイヤーは、それぞれ 2 つの線形のステープルに関連付けられている各 c64nt と c84nt の足場からアセンブルされます。CDAO c64nt、acDAO c64nt、cDAO-c74nt、または cDAO c84nt の各円形のタイルがそれぞれ c64nt、c74nt、または 4 つの線形ステープル c84nt の対応する足場からアニールされます。無限の 2次元格子は同じ種類の異なるシーケンスを持つ 2 つの円形タイルから組み立てられて。それぞれ、32 の円形部分のタイルの 2 つのセットから 2 つの有限の 2 D 矩形格子をまとめます。お金を節約するには、だけ 1 つシーケンス処理した c64nt、c74nt、および c84nt としてそれぞれの足場 32 cDAO c64nt、12 cDAO-c74nt、および最初のサブ タイル アニーリング ステップでそれぞれ 20 cDAO c84nt 円形サブ タイルをアニールし別のオーバー ハングが使用されて対応する 32 の円形のサブのタイルを一緒に混合し、それぞれ cDAO-c64nt-O の有限 5 × 6、5 × 6 84nt &o cDAO c74 格子をアセンブルする手順を焼鈍第 2 格子を適用します。間違いなく、しかしより多くのお金と労力がかかりますさまざまな有限サイズのナノ構造を組み立てるために円形の足場の異なるシーケンスが適用できます。無限 1 次元 acDAO-c64nt-E ナノリングと nanospirals は、4 回転半の偶数の線形結合の 1 つシーケンス処理した非対称 acDAO c64nt タイルからアニールされます。CDAO c64nt と cDAO-c84nt、それぞれの 4 と 5 回転半数が奇数偶数の intertile の距離によって区別される円形タイルから無限の 2次元格子をアセンブルする方法の 2 種類があります。同じように配置するすべてのタイルが要求されます。後者のヘリカル軸に沿って 2 つの隣接タイル面の交替が必要です。タイルである剛性と平面 cDAO c64nt など、両方のアプローチは平面のナノリボン; を生成します。タイルは cDAO-c84nt、4 の偶数の intertile 接続など、1 つの方向に向かって曲がるかどうかに対し、半分の回転はナノチューブを生成する 5 の数が奇数の intertile 接続半分の回転の除去による平面ナノリボンが生成されます湾曲したタイルの代替配置による曲率偏った成長。円形のタイルから 1 D および 2 D DNA ナノ構造体のアセンブリが成功したこの新たなアプローチのいくつかの利点を示す: 安定性と線形タイル上円形タイル、非対称ナノ構造のアセンブリのキラル タイルの剛性をよう強制ナノリングおよびナノリボン、 DNA の力学、分子構造などを理解することで新たなビジョン。
Protocol
Representative Results
Discussion
小さな環状 dna の合成と DNA ナノ構造体のアセンブリにこの記事のフォーカス表示プロトコル。DNA デザインのランダム シーケンスのほとんどは、このプロトコルで使用できます。円形の Dna の純度は、DNA アセンブリの成功にとって重要です。環化反応の生産量は、5′-リン酸化線形 DNA の濃度を下げることによって向上させることがただし、円形の DNAs の同じ量を生産するワークロードが増加?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NSFC (助成金第号 91753134 と 21571100)、および状態キー研究所のバイオの東南大学から財政支援に感謝しております。
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
References
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