המוטיבים אן יציב, 1 י ו- 2D Nanostructures בנוי מולקולות DNA מעגלי קטן
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור T4 מצדו ולטיהור denaturing דף קטן מולקולות DNA מעגלי, חישול, ניתוח דף מקורית של אריחים מעגלית, בהרכבת AFM הדמיה של nanostructures ה-DNA 1 י ו- 2D, כמו גם agarose ג’ל אלקטרופורזה וטיהור צנטריפוגה של סופי אן nanostructures.
Abstract
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של סינתזה של מולקולות DNA מעגלי קטנות, חישול של מעגלי DNA מוטיבים ובניית nanostructures DNA 1 י ו- 2D. במשך עשרות שנים, הפיתוח המואץ של ננוטכנולוגיית דנ א מיוחס השימוש DNAs ליניארית כמו למקורות ראשוניים. לדוגמה, המשבצת דאו (כפול מוצלב, antiparallel, מוזר. מסתבר חצי) היא ידועים כמו אבן בניין להקמת רשתות ה-DNA 2D; המבנה הליבה של DAO עשוי שתי oligonucleotides חד גדילי לינארי (הה), כמו שני חבלים עושה קשר סבתא יד ימין. במסמך זה, סוג חדש של אריחים DNA נקרא cDAO (בשילוב DAO) נבנים תוך שימוש קטן מעגלית ss-DNA של c64nt או c84nt (מעגלית 64 או 84 נוקלאוטידים) וגם סטרנד לגרדום מספר ליניארי האס. אס-DNAs כמו קווצות סיכות. Nanostructures 1D ו- 2D מושלם are התכנסו from cDAO אריחים: nanowires אינסופי, nanospirals, צינורות, nanoribbons; סופי ננו-מלבנים. פרוטוקולים מפורט מתוארים: 1) הכנה על ידי T4 ליגאז וטיהור על ידי denaturing עמוד (לזיהוי אלקטרופורזה בג’ל) של oligonucleotides עגול קטן, 2) חישול של אריחים מעגלית יציב, ואחריו ניתוח דף מקורית, 3) הרכבה של אינסוף 1 י nanowires, nanorings, nanospirals, פומפיה 2D אינסופי של צינוריות nanoribbons ו ננו 2D סופיים-מלבנים, ואחריו AFM (מיקרוסקופ כוח אטומי) הדמיה. השיטה היא פשוטה, חזקים, במחיר סביר עבור רוב מעבדות.
Introduction
היו בשימוש במולקולות דנ א כדי לבנות סוגים רבים של nanostructures במשך עשרות שנים. מוטיבים אופייניים כוללים דיי (מוצלב זוגי, antiparallel, אפילו חצי. מסתבר) ורווקה DAO אריחים1,2,3, אריחים כוכב4,5,6,7, תקועים (הה) אריחים8,9,10, ו- DNA אוריגמי11,12,13. אלה המוטיבים אן, פומפיה are התכנסו from ss ליניארי-DNAs. לאחרונה, אנחנו ואחרים דיווחו השימוש של האס. אס מעגלית-oligonucleotides כמו פיגומים לבנות מוטיבים, צינורות 1 י, ואת רשתות 2D14,15,16,17. על-ידי הוספת הולידיי לצומת (ג’ונסון)18,19,20,21 במרכז c64nt, זוג שני אריחים DAO בשילוב יכול להיות בנוי17. זה מוטיב cDAO חדש ונגזרותיו יציבים, DNA נוקשה מספיק כדי להרכיב 2D סורגים עד 3 × 5 מיקרומטר2. בנייר זה, אנו משתמשים מונח של “אריח מעגלית”, אשר מוגדר יציב DNA מורכב מולקולה נבנה עם אחד לגרדום מעגלית ומקומות ליניארי של האס. אס-oligonucleotides, מונח אחר של “אריח ליניארי”, אשר נבנה מתוך ערכה מלאה של ליניארי אס-oligonucleotides.
פרוטוקול זה מדגים כיצד לבנות חמישה סוגים של ה-DNA nanostructures עם מולקולות DNA מעגלי קטן כמו פיגומים: nanowires c64nt ו- c84nt 1 י 1) אינסופי, אינסוף 2) 2D cDAO-c64nt-O, cDAO-c64nt-E (-O מייצגת מספר אי-זוגי של 5. מסתבר חצי ו- E פומפיה מייצג מספר זוגי של חצי-הופכת 4), 3) אינסופי 2D cDAO-c84nt-O ו- cDAO-c84nt-E פומפיה, 4) סופית 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O ו- 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O מלבנים, 5) אינסופי 1 י acDAO-c64nt-E nanorings ו- nanospirals (עיין איור 3-5 סכמטי ציורים, תמונות של חמישה סוגי הדנ א nanostructures לעיל). 1 י c64nt ו- c84nt nanowires are התכנסו from כל לגרדום c64nt ו- c84nt הקשורים עם שתי סיכות ליניארי בהתאמה. כל אריח מעגלית של cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt או cDAO-c84nt הוא annealed מ שלה לגרדום המתאים של c64nt, c74nt או c84nt עם ארבע סיכות ליניארי בהתאמה. פומפיה 2D אינסופי הם התאספו מאותו סוג? של שני אריחים מעגלית עם רצפים שונים. פומפיה מלבן 2D סופית שני are התכנסו from שתי ערכות של 32 אריחים תת מעגלית בהתאמה. כדי לחסוך כסף, c64nt רק אחד רציף, c74nt ו- c84nt משמש לגרדום המתאימים בזמן המסוכך שונות משמשות anneal של 32 cDAO-c64nt, cDAO 12-c74nt, ואריחי cDAO 20-c84nt מעגלית משנה בהתאמה בשלב הראשון אריח תת מחזק, אז מערבבים יחד המתאימים 32 מעגלית תת האריחים ולהחיל בסריג השני חישול שלב להרכיב את סופי 5 × 6 cDAO-c64nt-O ו- 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O רשתות, בהתאמה. . בהחלט, וסודרו באופן שונה פיגומים מעגלית ניתן לאמץ להרכיב מגוון רחב של גודל סופי nanostructures, אולם זה יעלה יותר כסף, עמל. Nanorings acDAO-c64nt-E 1D אינסופי של nanospirals הם annealed האריחים רציף אחד אסימטרי acDAO-c64nt עם חיבורי ליניארי של מספר זוגי של חצי 4. מסתבר. ישנן שתי גישות להרכיב אינסוף פומפיה 2D האריחים מעגלית של cDAO-c64nt ו- cDAO-c84nt, אשר נבדלים על ידי מרחקים intertile של מספר זוגי של 4 ומספר אי-זוגי של חצי 5. מסתבר בהתאמה. לשעבר דורש כל האריחים ייושר באופן זהה; האחרון דורש ניטור פניהם של שני האריחים הסמוכים לאורך הצירים הסליל. אם המשבצת מישורי, כגון cDAO-c64nt הנוקשה, שתי הגישות יפיק nanoribbons מישורי; אם המשבצת מעוקם לכיוון בכיוון אחד, כגון cDAO-c84nt, חיבור intertile של מספר זוגי של 4 פונה חצי יפיק צינוריות, ואילו החיבור intertile של מספר אי-זוגי של 5 פונה חצי יפיקו מישורי nanoribbons בשל חיסול מוטה-עקמומיות הצמיחה על ידי יישור חלופי של אריחים מעוקל. הרכבה מוצלחת של nanostructures ה-DNA 1 י ו- 2D האריחים מעגלית מציין מספר יתרונות של גישה חדשה זו: לאכוף את יציבות, קשיחות של אריחים מעגלית על אריחים ליניארי, אריחים כיראלי להרכבת סימטרית nanostructures כגון nanorings, nanoribbons, חזיונות חדשים על להבין את מכניקת הדנ א ואת מבנה מולקולרי, וכו ‘.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים הציג באופן זה דגש במאמר על הסינתזה של מולקולות DNA מעגלי קטנות, ההרכבה של דנ א nanostructures. רוב העיצובים DNA וסודרו באופן אקראי ניתן להשתמש בפרוטוקול זה. טוהר DNAs מעגלית היא קריטית להצלחת הרכבות ה-DNA. ניתן לשפר את התשואה הפקה של cyclization על-ידי הורדת הריכוז של DNA ליניארי 5′-phosphorylated; עם זאת, זה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
. אנחנו אסירי תודה על התמיכה הכספית של NSFC (מענקים מס ‘ 91753134 ו- 21571100), ואוניברסיטת מדינת מפתח מעבדה של Bioelectronics של דרום-מזרח.
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
References
- Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
- Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
- Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
- Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
- Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
- Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
- Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
- Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
- Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
- Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
- Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1 (1), 157-181 (1990).
- Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
- Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
- Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579 (1985).
- Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).
