Stabil DNA motiv, 1D och 2D nanostrukturer tillverkad av små cirkulära DNA-molekyler
Summary
Denna artikel presenterar en detaljerad protokoll för T4 ligering och denatureringen sida rening av små cirkulära DNA-molekyler, glödgning och infödda sida analys av cirkulära plattor, montering och AFM avbildning av 1D och 2D DNA nanostrukturer samt agaros gel elektrofores och centrifugering rening av ändliga DNA nanostrukturer.
Abstract
Denna artikel presenterar en detaljerad protokoll för syntes av små cirkulära DNA-molekyler, glödgning av cirkulära DNA motiv och byggandet av 1D och 2D DNA nanostrukturer. Under årtiondena, är den snabba utvecklingen av DNA nanoteknik tillskrivs användning av linjära DNAs som råvara. Till exempel är panelen DAO (dubbla crossover, antiparallel, udda halv-vänder) välkänd som en byggsten för byggandet av 2D DNA galler; core struktur DAO är tillverkad av två linjära enkelsträngat (ss) oligonukleotider, som två linor att göra en höger hand mormor knut. Häri, en ny typ av DNA plattor kallas cDAO (kopplat DAO) byggs med hjälp en liten cirkulär ss-DNA i c64nt eller c84nt (cirkulär 64 eller 84 nukleotider) som byggnadsställning strand och flera linjära ss-DNAs som krampa trådar. Perfekt 1D och 2D nanostrukturer monteras från cDAO plattor: oändlig nanotrådar, nanospirals, nanorör, nanobanden; och ändlig nano-rektanglar. Detaljerade protokoll beskrivs: 1) förberedelse av T4 ligase och rening av denaturering sida (polyakrylamid gelelektrofores) av små cirkulära oligonukleotider, 2) glödgning av stabil cirkulära plattor, följt av infödda sidanalys, 3) montering av oändlig 1D nanotrådar, nanorings, följt nanospirals, oändlig 2D galler av nanorör och nanobanden och ändliga 2D nano-rektanglar, av AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. Metoden är enkel, robust och prisvärd för de flesta laboratorier.
Introduction
DNA-molekyler har använts för att bygga många typer av nanostrukturer över årtionden. Typiska motiv innehåller DAE (double crossover, antiparallel, även halv-varv) och DAO plattor1,2,3, star plattor4,5,6,7, enda strandsatta (ss) plattor8,9,10, och DNA origami11,12,13. Dessa DNA motiv och galler monteras från linjär ss-DNAs. Nyligen har andra och vi rapporterade användning av cirkulär ss-oligonukleotider som ställningar att bygga motiv, 1D nanorör och 2D galler14,15,16,17. Genom att sätta en Holliday junction (HJ)18,19,20,21 i mitten av c64nt, kan ett par av två kopplade DAO plattor vara bildade17. Detta nya cDAO motiv och dess derivat är stabil och tillräckligt styv för att montera 2D DNA galler upp till 3 × 5 µm2. I detta papper använder vi en benämna av ”cirkulära plattor”, som definieras som en stabil komplexa DNA-molekyl som konstruerat med en cirkulär byggnadsställning och andra linjära märlor av ss-oligonukleotider, och en annan term för ”linjära kakel”, som är byggd från en full uppsättning av linjära SS-oligonukleotider.
Detta protokoll visar hur att bygga fem sorters DNA nanostrukturer med små cirkulära DNA-molekyler som ställningar: 1) oändlig 1 D c64nt och c84nt nanotrådar, 2) oändlig 2D cDAO-c64nt-O och cDAO-c64nt-E (-O representerar ett udda antal 5 halv-svängar och -E representerar ett jämnt antal av 4 halv-varv) galler, 3) oändlig 2D cDAO-c84nt-O och cDAO-c84nt-E galler, 4) ändlig 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O och 5 × 6 cDAO-c 74 & 84nt-O rektanglar, 5) oändlig 1 D acDAO-c64nt-E nanorings och nanospirals (se Figur 3-5 för schematiska ritningar och bilder av de ovanstående fem typer av DNA nanostrukturer). De 1D c64nt och c84nt nanotrådar monteras från varje c64nt och c84nt byggnadsställning är associerad med två linjära klammer respektive. Varje cirkulär platta av cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt eller cDAO-c84nt är glödgas från dess motsvarande byggnadsställning av c64nt, c74nt eller c84nt med fyra linjär klammer respektive. De oändliga 2D galler monteras från samma typ av två cirkulära plattor med olika sekvenser. De två ändliga 2D rektangel galler monteras från två uppsättningar av 32 cirkulär sub plattor respektive. För att spara pengar, används endast en-sekvenserade c64nt, c74nt och c84nt som respektive schavotten medan olika överhäng används att glödga den 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt och 20 cDAO-c84nt cirkulär sub plattor respektive i första sub kakel glödgning steg, sedan Blanda motsvarande 32 cirkulär sub brickor och tillämpa andra gallret glödgning steg för att montera den ändliga 5 × 6 cDAO-c64nt-O och 5 × 6 cDAO-c 74 & 84nt-O galler, respektive. Definitivt, annorlunda sekvenserade cirkulär ställningar kan antas för att montera en mängd ändlig storlek nanostrukturer, men det kommer att kosta mer pengar och mödor. Den oändliga 1D acDAO-c64nt-E nanorings och nanospirals är glödgas från en-sekvenserade asymmetriska acDAO-c64nt plattor med linjära anslutningar av ett jämnt antal 4 halv-varv. Det finns två metoder att montera oändlig 2D galler från cirkulära plattor cDAO-c64nt och cDAO-c84nt, som kännetecknas av intertile distanserar av ett jämnt antal 4 och ett udda antal 5 halv-vänder respektive. Den förstnämnda kräver alla brickor anpassas identiskt; det senare kräver alternationen av ansiktena på två intilliggande brickor längs de spiralformade axlarna. Om panelen är styv och plana, såsom cDAO-c64nt, kommer att båda metoderna generera planar nanobanden; Om panelen är böjd mot en riktning, såsom cDAO-c84nt, intertile anslutningen av ett jämnt antal 4 halv varv kommer att generera nanorör, medan intertile anslutningen av ett udda antal 5 halv varv kommer att producera planar nanobanden på grund av avskaffandet av krökning-partisk tillväxt vid alternativa justering av böjda plattor. Framgångsrika montering av 1D och 2D DNA nanostrukturer från cirkulära plattor anger flera fördelar med denna nya strategi: verkställas stabilitet och styvhet av cirkulära plattor över linjära plattor, kirala plattor för montering av asymmetriska nanostrukturer som nanorings och nanobanden, nya visioner på förståelse av DNA mekanik och molekylära strukturer, etc.
Protocol
Representative Results
Discussion
De protokoll som presenteras i denna artikel fokuserar på syntesen av små cirkulära DNA-molekyler och montering av DNA nanostrukturer. De flesta av slumpmässigt sekvenserade DNA-mönster kan användas i detta protokoll. Renhet av cirkulär DNAs är avgörande för framgången av DNA församlingar. Produktionen avkastningen av ringbildning kan förbättras genom att sänka koncentrationen av 5′-fosforyleras linjära DNA; emellertid kommer detta öka arbetsbelastningen för att producera samma mängder av cirkulär DNA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för finansiellt stöd från NSFC (bidrag nr 91753134 och 21571100), och den nyckel laboratorium av bioelektronik av Southeast delstatsuniversitet.
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
References
- Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
- Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
- Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
- Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
- Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
- Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
- Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
- Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
- Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
- Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
- Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1 (1), 157-181 (1990).
- Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
- Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
- Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579 (1985).
- Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).
