Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben
Summary
Mikroglia, die ansässigen Immunzellen des Gehirns, reagieren schnell auf Änderungen ihrer Umgebung mit morphologischen Veränderungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie zwei-Photonen-Mikroskopie zu verwenden, um die Anziehungskraft der Mikroglia Prozesse gegenüber Serotonin oder ATP in akuten Hirnschnitten von Mäusen zu studieren.
Abstract
Mikroglia-Zellen sind resident angeborenen immunen Zellen des Gehirns, die ständig ihre Umgebung mit ihren langen Prozessen absuchen und bei Störung der Homöostase, schnelle morphologische Veränderungen durchlaufen. Zum Beispiel induziert eine Laser-Läsion in wenigen Minuten eine ausgerichtete Wachstum von Mikroglia Prozesse, auch genannt “direktionale Motilität”, in Richtung der Stelle der Verletzung. Eine ähnliche Wirkung kann erzielt werden, durch die Bereitstellung lokal ATP oder Serotonin (5-Hydroxytryptamine [5-HT]). In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll eine gerichtete Wachstum der Mikroglia Prozesse in Richtung einer lokalen Anwendung von ATP oder 5-HT in akuten Hirnschnitten von jungen und Erwachsenen Mäusen zu induzieren, um diese Attraktion im Laufe der Zeit durch multiphoton Mikroskopie Bild. Eine einfache Methode zur Quantifizierung mit freien und Open-Source Bildanalyse-Software wird vorgeschlagen. Eine Herausforderung, die nach wie vor akuten Gehirnscheiben charakterisiert ist die begrenzte Zeit, verringern mit dem Alter, in dem die Zellen in einem physiologischen Zustand bleiben. Dieses Protokoll ist somit Höhepunkte einige technischen Verbesserungen (Mittel, Luft-Flüssigkeit Schnittstelle Kammer, Kammer mit einer doppelten Perfusion imaging) zur Optimierung der Lebensfähigkeit der Mikroglia-Zellen über mehrere Stunden, vor allem in Scheiben von Erwachsenen Mäusen.
Introduction
Mikroglia-Zellen sind resident Makrophagen des Gehirns und eine Rolle in beiden physiologischen und pathologischen Bedingungen1,2. Sie sind haben eine stark verzweigte Morphologie und ständig erweitern und ihre Prozesse3,4einfahren. Dieses “Scan” Verhalten wird geglaubt, um Verwandte und notwendig, um den Überblick über ihre Umgebung werden. Die morphologische Plastizität der Mikroglia drückt sich in drei Modi. Zunächst einige Verbindungen schnell modulieren Mikroglia Morphologie: die Zugabe von ATP5,6 oder NMDA5,7 mittelfristig akute Gehirnscheiben Baden erhöht die Komplexität der Mikroglia Verzweigungen während Noradrenalin es6 sinkt. Diese Effekte sind direkt vermittelt durch Mikroglia-Rezeptoren (für ATP und Noradrenalin) oder erfordern eine ATP-Freisetzung von Neuronen (NMDA). Zweitens kann die Wachstum und Retraktion Geschwindigkeit der Mikroglia Prozesse, Motilität oder “Surveillance”, genannt extrazellulären Faktoren8, Homöostase Störungen9,10oder Mutationen9betroffen sein, 10,11. Drittens: Neben diesen isotropen Änderungen der Morphologie und Motilität Mikroglia haben die Fähigkeit, ihre Prozesse gerichtet in Richtung einer Pipette liefert ATP3,5,12, zu verlängern 13 , 14, in der Kultur, in akuten Gehirnscheiben oder in vivo, oder liefern 5-HT in akuten Gehirn Scheiben15. Solches orientierte Wachstum Mikroglia Prozesse, auch genannt gerichtete Motilität, wurde als Reaktion auf eine lokale Laser Läsion3,4erstbeschrieben. Also physiologisch, es kann im Zusammenhang mit der Reaktion auf eine Verletzung oder erforderlich für targeting Mikroglia Prozesse in Richtung Synapsen oder Hirnregionen erfordern Rebschnitt während Entwicklung15,16, oder im physiologischen17 ,18,19 oder pathologischen Situationen9,18,19,20 im Erwachsenenalter. Die drei Arten von morphologischen Veränderungen setzen auf verschiedene intrazelluläre Mechanismen11,13,20, und einer bestimmte Verbindung nicht unbedingt modulieren alle von ihnen (z. B. NMDA, die indirekt auf wirkt Mikroglia, wirkt auf die Morphologie aber nicht dazu veranlassen, direktionale Motilität5,7). Mit dem Ziel, die Wirkung des eine Verbindung, eine Mutation oder eine Pathologie auf Mikroglia charakterisieren, ist es daher wichtig, die drei Komponenten ihre morphologische Plastizität zu charakterisieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der gerichteten Wachstums der Mikroglia Prozesse in Richtung einer lokalen Quelle Verbindung, was hier ist, ATP oder 5-HT.
Es gibt mehrere Modelle, Mikroglia Prozesse Attraktion zu studieren: Primärkulturen 3D-Umgebung6,18,19, akute Gehirn Scheiben6,13,15, und in Vivo Imaging-3,13. Der in-vivo-Ansatz ist die beste, die physiologische Zustand der Mikroglia zu bewahren. Allerdings intravitalen Bildgebung des tiefen Regionen erfordert komplexe chirurgische Eingriffe und daher ist es oft auf oberflächliche kortikalen Schichten beschränkt. Die Verwendung von Mikroglia Primärkultur ist die einfachste Technik, um eine große Anzahl von Bedingungen mit einer begrenzten Anzahl von Tieren zu testen. Dennoch ist es unmöglich, die gleiche Zelle Morphologie wie in Vivo zu erhalten, und Zellen verlieren ihre physiologischen Wechselwirkungen mit Neuronen und Astrozyten. Akute Gehirnscheiben sind ein Kompromiss zwischen diesen beiden Ansätzen. Dieses Modell erlaubt Forschern, Hirnstrukturen zu studieren, die sonst schwer zu erreichen und zu Bild mit hoher Auflösung in-vivo und Scheiben von Neugeborenen Stadien zu untersuchen sind, während die transkranielle Mikroskopie meistens im Erwachsenenalter durchgeführt wird. Schließlich macht es möglich, die Auswirkungen von lokalen Zulassungsantrag in Echtzeit zu beobachten, und versuche zu wiederholen, wobei eine begrenzte Anzahl von Tieren. Dennoch ist ein Problem mit akuten Gehirnscheiben der begrenzten Zeit (einige Stunden), während die Zellen am Leben, insbesondere für Scheiben von Mäusen, die älter als zwei Wochen, und die mögliche Änderung der Mikroglia Morphologie über Zeit21,22 bleiben .
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur akuten Hirnschnitten von jungen und Erwachsenen Cx3cr1 bereitenGLP / + Mäuse bis zu zwei Monate alt, mit der Erhaltung der Mikroglia Morphologie und Motilität für mehrere Stunden. Wir beschreiben, wie diese Scheiben zu verwenden, um die Anziehungskraft der Mikroglia Prozesse in Richtung Verbindungen wie ATP oder 5-HT zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durch die Beibehaltung, anders als in dissoziiert oder organotypischen schneiden Kultur, eine strukturelle Integrität mit begrenzten Anpassungen, akute Gehirnscheiben erlauben Forschern, Mikroglia in ihrer physiologischen Umgebung zu studieren. Eine wichtige Einschränkung ist jedoch die Tatsache, dass die Slice Prozedur Verletzungen erstellt, die schnell die Lebensfähigkeit von Neuronen, besonders im erwachsenen Gehirn beeinträchtigen können. Mikroglia sind besonders reaktiv zu Zellschäden, ist es wichtig, neuronal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Zelle und Gewebe Imaging Facility des Institut du Fer À Moulin, wo alle Bildaufnahme und Analysen durchgeführt wurden. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch das Centre National De La Recherche Scientifique, Institut National De La Santé et De La Recherche Médicale, Université Sorbonne Wissenschaften, und durch Zuschüsse von Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie-Universität () Emergence-UPMC Programm 2011/2014), die Fondation pour la Recherche Sur le Cerveau, Fondation de France, die Fondation pour la Recherche Médicale “Equipe FRM DEQ2014039529”, dem französischen Forschungsministerium (Agence Nationale Pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 und des Investissements Avenir Programm “Bio-Psy Labex” ANR-11-IDEX-0004-02) und Kooperationsforschung in Computational Neuroscience Programm, National Science Foundation/Französisch National Agency for Research (Nummer: 1515686). Alles, was die Autoren angehören, um Forschung Gruppen, die Mitglieder der Paris School of Neuroscience (ENP) und der Bio-Psy Labex sind. Z.B. ist ein Ph.d. Student angegliedert Sorbonne Université, Collège Doktoranden, F-75005 Paris, Frankreich, und wird durch die Bio-Psy Labex finanziert. Caracterización ist ein Post-Doktorand geförderten Sonderforschungsbereichs Computational Neuroscience Programm, National Science Foundation/Französisch National Agency for Research (Nummer: 1515686). Die Autoren danken Marta Kolodziejczak, die bei der Initiierung des Projekts teilgenommen.
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
References
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