Imaging del due-fotone di attrazione dei processi Microglial verso ATP o serotonina nelle fette del cervello acuto
Summary
Microglia, le cellule immunitarie residente del cervello, di rispondere rapidamente con i cambiamenti morfologici a modificazioni del loro ambiente. Questo protocollo viene descritto come utilizzare microscopia del due-fotone per studiare l’attrazione dei processi microglial verso la serotonina o ATP nelle fette acuta del cervello dei topi.
Abstract
Cellule della microglia sono cellule immuni innate residente del cervello che costantemente la scansione loro ambiente con i loro processi lunghi e, al momento di rottura dell’omeostasi, subiscono rapidi cambiamenti morfologici. Ad esempio, una lesione laser induce in pochi minuti una crescita orientata dei processi microglial, chiamato anche “motilità direzionale”, verso il luogo della ferita. Un effetto simile può essere ottenuto fornendo localmente ATP o serotonina (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In questo articolo, descriviamo un protocollo per indurre una crescita direzionale dei processi microglial verso un’applicazione locale di ATP o 5-HT in fettine di cervello acuto di topi giovani e adulti e per questa attrazione nel tempo della battuta da microscopia multifotonica. Viene proposto un semplice metodo di quantificazione con software di analisi di immagini gratuito e open-source. Una sfida che ancora caratterizza fette del cervello acuto è il periodo di tempo limitato, diminuisce con l’età, durante il quale le cellule rimangono in uno stato fisiologico. Questo protocollo, quindi, evidenzia alcuni miglioramenti tecnici (sezione imaging camera con un’aspersione doppia interfaccia medio, aria-liquido) volti ad ottimizzare la vitalità delle cellule microgliali sopra parecchie ore, soprattutto in fette da topi adulti.
Introduction
Cellule della microglia sono macrofagi residenti del cervello e svolgono un ruolo in entrambe le condizioni fisiologiche e patologiche1,2. Hanno una morfologia altamente ramificata e sono costantemente estendere e ritrarre i loro processi3,4. Questo comportamento “scansione” si crede di essere connessi e necessari per l’indagine del loro ambiente. La plasticità morfologica di microglia si esprime in tre modalità. In primo luogo, alcuni composti modulano rapidamente microglial morfologia: l’aggiunta di ATP5,6 o NMDA5,7 nel mezzo di balneazione fette del cervello acuto aumenta la complessità delle ramificazioni microglial, considerando che la noradrenalina diminuisce6. Questi effetti sono direttamente mediati dai recettori microglial (per ATP e noradrenalina) o richiedano un rilascio di ATP dai neuroni (per NMDA). In secondo luogo, la velocità di crescita e la ritrazione dei processi microglial, chiamato motilità o “sorveglianza”, può essere influenzata da fattori extracellulari8, omeostasi interruzioni9,10o mutazioni9, 10,11. In terzo luogo, oltre a queste modifiche isotropiche di morfologia e la motilità, microglia hanno la capacità di estendere i loro processi direzionalmente verso una pipetta fornire ATP3,5,12, 13 , 14, nella cultura, in fettine di cervello acuto o in vivo, o consegna 5-HT nel cervello acuto fette15. Tale crescita orientata dei processi microglial, chiamato anche motilità direzionale, in primo luogo è stato descritto come una risposta a un locale laser lesione3,4. Pertanto, fisiologicamente, può essere relazionato con la risposta alla lesione o necessaria per il targeting microglial processi verso sinapsi o regioni del cervello che richiedono potatura durante sviluppo15,16, o nel fisiologico17 ,18,19 o situazioni patologiche9,18,19,20 in età adulta. I tre tipi di cambiamenti morfologici si basano su diversi meccanismi intracellulari11,13,20, e un composto dato non necessariamente modula tutti loro (ad es., NMDA, che agisce indirettamente sul microglia, ha un effetto sulla morfologia ma non induce la motilità direzionale5,7). Pertanto, al fine di caratterizzare l’effetto di un composto, una mutazione o una patologia sulla microglia, è importante caratterizzare i tre componenti della loro plasticità morfologica. Qui, descriviamo un metodo per studiare la crescita direzionale dei processi microglial verso una fonte locale di composto, che è, qui, ATP o 5-HT.
Ci sono diversi modelli per lo studio di attrazione dei processi microglia: colture primarie in ambiente 3D6,18,19, cerebrale acuto fette6,13,15e in vivo 3,13di imaging. Approccio in vivo è il migliore per mantenere lo stato fisiologico di microglia. Tuttavia, videomicroscopia imaging di regioni profonde richiede interventi chirurgici complessi e, pertanto, è spesso limitato a strati corticali superficiali. L’uso di colture primarie di microglia è la tecnica più semplice per testare un gran numero di condizioni con un numero limitato di animali. Tuttavia, è Impossibile ottenere la stessa morfologia delle cellule come in vivo, e le cellule perdono la loro interazioni fisiologiche con neuroni e astrociti. Fette del cervello acuto rappresentano un compromesso tra questi due approcci. Questo modello permette ai ricercatori di studiare le strutture cerebrali che altrimenti sono difficili di raggiungere e di immagine ad alta risoluzione in vivo, per indagare fette dalle fasi neonatale, mentre transcranial microscopia è effettuata principalmente nell’età adulta. Infine, rende possibile osservare in tempo reale gli effetti dell’applicazione della droga locale e di ripetere gli esperimenti durante l’utilizzo di un numero limitato di animali. Tuttavia, un problema con le fette di cervello acuto è il tempo limitato (poche ore) durante il quale le cellule rimangono vive, in particolare per le sezioni da topi più vecchi di due settimane e il potenziale di cambiamento della morfologia di microglia sopra tempo21,22 .
Qui, descriviamo un protocollo per preparare fette di cervello acuto di giovani e adulti Cx3cr1GFP / + topi fino a due mesi, con la conservazione della motilità e morfologia di microglia per diverse ore. Abbiamo, quindi, descrivere come utilizzare queste fette per studiare l’attrazione dei processi microglial verso composti come ATP o 5-HT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mantenendo, a differenza di in dissociato o organotipiche affettare cultura, un’integrità strutturale con regolazioni di rete limitata, fettine di cervello acuto permettono ai ricercatori di studiare microglia nel loro ambiente fisiologico. Tuttavia, uno dei principali limiti è il fatto che la procedura per affettare crea le lesioni che possono rapidamente compromettere la vitalità dei neuroni, specialmente nel cervello adulto. Come la microglia è particolarmente reattivo al danno cellulare, è importante limitare il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la cellula e tessuto Imaging Facility del Institut du Fer à Moulin, dove sono state eseguite tutte le analisi e acquisizione delle immagini. Questo lavoro è stato supportato in parte dal Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, le scienze di Université Sorbonne e dalle sovvenzioni dalla Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie Università ( Programma Emergence-UPMC 2011/2014), la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation de France, la Fondation pour la Recherche Médicale “Equipe FRM DEQ2014039529”, il Ministero francese della ricerca (Agence Nationale pour la Recherche Programma di ANR-17-CE16-0008 e l’Avenir Investissements “Bio-Psy Labex” ANR-11-IDEX-0004-02) e una ricerca collaborativa nel programma di neuroscienze computazionali, National Science Foundation/francese Agenzia nazionale per la ricerca (numero: 1515686). Tutti gli autori sono affiliati per ricercare gruppi che sono membri del Paris School of Neuroscience (PEV) e del Labex Bio-Psy. F.E. è uno studente di dottorato di ricerca affiliato Sorbonne Université, Collège Doctoral, F-75005 Parigi, Francia ed è finanziato dal Labex Bio-Psy. V.M. è un post-dottorato finanziato la ricerca collaborativa nel programma di neuroscienze computazionali, National Science Foundation/francese Agenzia nazionale per la ricerca (numero: 1515686). Gli autori ringraziano Marta Kolodziejczak che hanno partecipato all’inizio del progetto.
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
References
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