Двух Фотон изображений микроглии процессов притяжения к СПС или серотонина в острой мозга фрагментов
Summary
Микроглии, резидентов иммунных клеток головного мозга, быстро реагировать с морфологические изменения изменения окружающей их среды. Этот протокол описывает, как использовать двух Фотон микроскопии для изучения притяжения микроглии процессов к серотонина или АТФ в кусочки острый мозга мышей.
Abstract
Клетки микроглии являются резидентов врожденные иммунные клетки головного мозга, которые постоянно сканировать их окружающей среды с их длинные процессы и, после нарушения гомеостаза, претерпевают быстрое морфологические изменения. Например лазер поражением индуцирует в течение нескольких минут ориентированный рост микроглии процессов, также называется «направленного подвижности», к месту травмы. Подобный эффект можно получить путем предоставления локально АТФ или серотонина (5-гидрокситриптамин [5-HT]). В этой статье мы опишем протокол побудить направленный рост микроглии процессов к местного применения СПС или 5-HT в острой мозга ломтики молодых и взрослых мышей и образ этот аттракцион с течением времени путем multiphoton микроскопии. Предложен простой метод количественной оценки с бесплатным и открытым исходным кодом изображения анализа программного обеспечения. Задача, которая по-прежнему характеризует кусочки острый мозга является ограниченное время, уменьшается с возрастом, в ходе которой клетки остаются в состоянии физиологического. Этот протокол, таким образом, освещаются некоторые технические усовершенствования (средний, воздух жидкий интерфейс камеры, изображение камеры с двойной перфузии), направленные на оптимизацию жизнеспособность Микроглии клеток в течение нескольких часов, особенно в ломтики от взрослых мышей.
Introduction
Микроглии клетки мозга-резидентов макрофаги и играть определенную роль в обоих физиологических и патологических условиях1,2. Они имеют весьма разветвленная Словотолкование и постоянно расширяя и втягивания их процессы3,4. Это «сканирования» поведение считается соответствующие и необходимые для обследования их окружение. Морфологическая пластичность микроглии выражается в трех режимах. Во-первых, некоторые соединения быстро модулировать микроглии Морфология: ATP5,6 или NMDA5,7 в средне-купание кусочки острый мозга увеличивает сложность микроглии последствия, в то время как норадреналина уменьшает его6. Эти эффекты являются непосредственно при посредничестве микроглии рецепторов (для СПС и норадреналина) или требуют АТФ-релиз от нейронов (NMDA). Во-вторых скорость роста и втягивание микроглии процессов, называемый подвижности или «надзор», могут быть затронуты внеклеточных факторов8,9,нарушения гомеостаза10или мутации9, 10,11. В-третьих помимо эти изотропной изменения морфологии и моторики, микроглии имеют потенциал для расширения их процессы направленно к пипетки доставки СПС3,5,12, 13 , 14, в культуре, в острой мозга ломтиками или в естественных условиях, или доставки 5-HT в острой мозга ломтики15. Такой ориентированный рост микроглии процессов, также называемый направленного моторики, впервые был описан как ответ на местные лазерной поражения3,4. Таким образом, физиологически, он может быть связанных с ответ на травмы или необходимых для ориентации микроглии процессов к синапсов или регионах мозга, требующие обрезки во время развития15,16, или в физиологических17 ,18,19 или патологических ситуаций9,18,19,20 в зрелом возрасте. Три типа морфологических изменений полагаются на различных внутриклеточных механизмов11,13,20, и один из данного соединения не обязательно модулировать все из них (например, NMDA, который действует косвенно на Микроглии, имеет влияние на морфологию, но не побудить направленного моторики5,7). Поэтому когда целью охарактеризовать воздействие соединение, мутации или патологии на микроглии, важно характеризуют три составляющих их морфологическая пластичность. Здесь мы описываем метод для изучения направления роста микроглии процессов к локальный источник соединения, который находится, здесь, АТФ или 5-HT.
Существует несколько моделей для изучения процессов микроглии притяжения: основных культур в 3D среде6,18,19, острый мозга ломтиками6,13,15и в естественных условиях изображение3,13. В естественных условиях подход является лучшим для сохранения физиологического государств микроглии. Однако прижизненной визуализации глубоких регионов требует сложных хирургических процедур, и, таким образом, это часто ограничивается поверхностных корковых слоев. Использование основной культуры микроглии является простой способ проверить большое количество условий с ограниченным количество животных. Тем не менее это невозможно для получения же морфологии клеток как в естественных условиях, и клетки теряют их физиологические взаимодействия нейронов и астроциты. Острый мозга фрагменты представляют собой компромисс между этими двумя подходами. Эта модель позволяет исследователям для изучения структуры мозга, которые иначе трудно достичь и изображений с высоким разрешением в естественных условиях и расследовать кусочки от новорожденных этапах, тогда как транскраниальной микроскопии осуществляется главным образом в зрелом возрасте. Наконец он делает его возможным для наблюдения в режиме реального времени эффекты применения местных наркотиков и повторить эксперименты, используя ограниченное количество животных. Тем не менее проблема с ломтиками острой мозга является ограниченное время (несколько часов), во время которой клетки остаются живы, особенно для фрагментов от мышей, старше, чем две недели и потенциальные изменения морфологии микроглии течение времени21,22 .
Здесь мы описываем протокол подготовить острый мозга ломтики молодых и взрослых Cx3cr1GFP / + мышей до двух месяцев, с сохранением микроглии морфологии и подвижность на несколько часов. Затем, мы, описывают, как использовать эти фрагменты для изучения притяжения микроглии процессов к соединений, как АТФ или 5-HT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поддерживая, в отличие от в отрыве или organotypic срез культуры, структурной целостности с ограниченной сети корректировок, острый мозга фрагменты позволяют исследователям изучить микроглии в их физиологической среде. Однако один из основных недостатков является тот факт, что нарезки про?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим клеток и тканей Imaging Institut du Fer à Мулен, где были выполнены все изображения сбора и анализа данных. Эта работа частично поддержали центр Национальной де ла Recherche Scientifique, Институт национального de la Santé et de la Recherche сообщала, наук университета Сорбонна и грантов университеты-Пьер Sorbonne et Мари Кюри университета ( Emergence-UPMC программа 2011-2014), Фонд pour la исследований sur le мозг, Фонд-де-Франс, Фонд pour la Recherche сообщала «Реактор FRM DEQ2014039529», Министерство научных исследований (Agence Nationale pour la исследований Франции Программа «Био-ПСИ Labex» АНР-11-IDEX-0004-02 ANR-17-CE16-0008 и будущее Investissements) и совместных исследований в программе вычислительных нейронаук, национальной науки фонд/французский Национальное агентство для исследований (число: 1515686). Все авторы связаны в исследовательских групп, которые являются членами Парижской школы нейронаук (ENP) и био-ПСИ Labex. Отвязка является аспирантом, аффилированным с Sorbonne Université Collège докторские, F-75005 Париж, Франция и финансируется био-ПСИ-Labex. В.м. является членом после защиты докторской диссертации, финансируемых совместных исследований в программе вычислительных нейронаук, национальной науки фонд/французский Национальное агентство для исследований (число: 1515686). Авторы благодарят Marta Kolodziejczak, которые участвовали в начало проекта.
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
References
- Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
- Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).
- Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).
- Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
- Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Wu, L. -. J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
- Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
- Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
- Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
- Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , 221-242 (2014).
- Mainen, Z. F., et al. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18 (2), 231-239 (1999).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
- Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).
