在这里, 我们提出了一个协议来描述的方法, 在一次爆炸创伤性脑损伤 (bTBI) 后, 使用隔离, 加压, 啮齿类动物中脑动脉 (MCA) 段的体外血管反应性测定。bTBI 感应是使用激波管 (也称为高级爆破模拟器 (ABS) 装置) 完成的。
虽然已经对爆炸暴露的组织病理学和行为影响进行了研究, 但致力于爆炸脑血管效应的研究较少。撞击 (即非爆炸性) 创伤性脑损伤 (tbi) 被认为可以降低人类和实验动物脑血管中的压力自动调节。通过测量啮齿类动物中动脉 (Mca) 中对降低血管内压的肌源性扩张反应, 检验了与撞击 TBI 一样的致突变性创伤性脑损伤 (BTBI) 导致脑血管反应受损的假设使用先进的爆破模拟器 (ABS) 激波管从老鼠身上受到轻度 bTBI 的影响而产生的片段。成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠被麻醉、插管、通风并为 Sham bTBI (除爆炸损伤外的相同操作和麻醉) 或轻度 bTBI 做好准备。老鼠被随机分配接受 Sham bTBI 或轻度 bTBI, 然后在受伤后牺牲30或60分钟。在 bTBI 后, 立即评估纠正反射 (RR) 抑制时间, 在损伤后的时间点的安乐死完成, 大脑被收获, 并收集, 安装和加压的个别 MCA 段。由于通过动脉段灌注的腔内压力以20毫米汞柱增量从100毫米汞柱减少到20毫米汞柱, 因此测量并记录了 MCA 直径。随着腔内压力的降低, SHAM bTBI 组的 MCA 直径明显高于基线, 而两个 bTBI 组的 MCA 扩张器反应显著降低 (p < 0.05), 受损的人、较小的群体就证明了这一点。记录 bTBI 组的 MCA 直径。此外, bTBI 组的 RR 抑制明显高于 Sham bTBI 组 (p < 0.05)。从 Sham bTBI 组收集的 MCA 表现出典型的血管舒张特性, 降低了腔内压力, 而 MCA 在 bTBI 之后采集的 MCA 对降低压力的肌源性血管舒张反应明显受损。bTBI 后至少坚持60分钟。
与撞击 (即非爆炸) TBI类似, 爆炸性创伤性脑损伤 (btbi) 与脑血管损伤1和受损的脑血管代偿反应有关, 如二氧化碳 (paco2)2、3、4和氧气 (pao2)5的分压变化。此外, 爆炸暴露已导致6例和 btbi 患者脑动脉血管痉挛7,8。虽然临床 tbi9和液体撞击损伤 (fpi)10,11,12与脑血管对动脉血压变化的反应受损有关 (即,压力自调节)9,10,11, 12, btbi 对脑血管压力自调节能力的影响仍存在不确定性.
大脑循环对全身动脉压力的变化做出反应, 目的是维持持续的氧气和营养物质供应, 提供给代谢活跃的大脑13,14,15, 16岁一种独特的稳态, 自动调节17,18, 19 发生时, “一个器官保持恒定的血液流动, 尽管血液 (灌注) 压力或其他生理或病理刺激的变化”20. 大脑动脉因血压、一氧化氮 (no)、血液粘度、paco2 和 pao2等4、11、16、 21. 动脉肌源反应是指这种收缩或扩张。最初由 Bayliss22描述的肌原血管反应和导致 CBF 自动调节的主要机制, 其特征是血管收缩, 如果灌注压力增加和血管舒张, 如果灌注压力降低14,17. 这种血管反应是收缩组织 (如血管平滑肌细胞, vsmc 的) 对腔和壁张力 23, 24的拉伸和变化的内在反应能力,25、26、27、28、29。当动脉拉伸时 (例如,在血管内压力增加的过程中), vsmc 的约束为24、25、26、28。
体外检查阻力血管的研究通常采用两种方法中的一种来测试分离的阻力血管的药理和生理特性: 环形安装方法和插管加压法。环状容器制备方法包括两根导线通过容器段的内部铝制, 而该部分将该部分固定在适当的位置。测量在等距固定的电线上施加的力的大小测量 VSMC 的刺激。然而, 这种技术带有一定的保留, 最明显的是, 当电线通过30时, 腔的内皮层所遭受的不可避免的损害, 以及孤立部分所承受的不同程度的伸展这反过来又导致血管壁扩张, 最终影响血管对药理剂的敏感性31。插管加压血管制备方法采用了由两个独立的室组成的动脉图, 每个室都放置从单个动物中收获的大脑中动脉 (MCA)。微移液器入段的每一端 , 段的近端用缝合线固定在微移液器上 , 腔用生理盐溶液 ( PSS ) 轻轻灌注 , 以消除血液和任何其他物质。然后用缝合线固定远端。经壁画或管腔压力是通过将连接在每个移液器上的两个水库提升到每个段上方的适当高度, 但相对于其他32、33、34、35的高度,设置的 ,36岁。沿储层和微型移液器的压力传感器提供灌注压力测量, 而船舶则使用配有显示器、摄像机和标尺的倒置显微镜放大, 从而可以测量外部MCA 直径。虽然这两种方法都很有价值, 但插管、加压容器的制备方法更好地模拟了, 并使被调查的容器更接近其体内条件32、37。
不同类型的撞击 (即非爆炸) tbi 对脑血管反应的影响已在脑动脉段21,35,36,38研究过.如目前的研究所述, 使用类似的体外 MCA 协议进行血管收集、安装和灌注, 早期的研究通过各自对脑血管功能障碍相关机制的研究取得了成功遵循 TBI。Golding 等人34 检查内皮介导扩张成人, 男性 LON-EVANS 大鼠 MCA 后严重 TBI 通过控制皮质撞击 (cci) 伤害。在第二项研究中, Golding 等人 36 研究了从维持轻度 cci 的大鼠身上收获 mca 后脑血管对低血压或二氧化碳的反应。Yu 等人38 分析了过氧亚硝酸盐清除剂是否改善了成年雄性 SPRAGUE-DAWLEY 大鼠 mca 段对降低血管内压力的扩张反应, 而 Mathew 等人21研究了对其肌原反应的影响。中度中央 FPI 后收获的 MCA 低血压。
为了更好地研究 bTBI 与非爆炸 TBI 一样导致脑血管反应受损的假设, 我们通过测量肌源性扩张反应降低血管压力来测试一种机制, 从而导致自我调节受损在使用先进的爆破模拟器 (Abs) 激波管模型从受到轻度 bTBI 影响的大鼠身上收集的隔离的、加压的啮齿类动物 MCA 段中的体外 (图 2和图 3) ( 见rodriguez 等人。表 1)利用直接传送到驾驶室的压缩空气产生类似 Freidlander-like的 40波超压和低压波 (见 rodriguez 等人,见图 1a)。
图 1: 大脑中动脉 (MCA) 的位置.大鼠大脑的中心视图突出了 MCA 相对于大脑后动脉 (PCA)、颈内动脉 (ICA)、颈外动脉 (ECA)、基底动脉 (BA) 和颈总动脉 (CCA) 的位置。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 先进的爆破模拟器 (abs) 激波管装置.ABS 用于在所有研究动物中产生初级爆炸损伤。1 = 驾驶室;2 = 膨胀室; 3 = 样品室;4 = 反射波抑制器;黄色星形 = 样品托盘。请点击这里查看此图的较大版本.
与所有协议和指令一样, 必须尽可能准确和准确地遵循这项特定研究中的协议的某些步骤。在大鼠的初始插管后, 重要的是要确认它呼吸稳定, 没有困难。错误地将气管插管进入食道而不是气管会导致抽搐、呼吸困难、出血, 以及随后由于麻醉无效输送到肺部而被唤醒的大鼠。
当在驱动程序和膨胀室之间的开口中心上贴上 mylar 膜片时, 必须将其居中, 并覆盖整个开口 39,41。在开口上方对片片进行错位将导致驾驶室漏气, 膜爆裂电位所需压力下降, 并拒绝给出爆炸伤害。正确地放置和安全地安装配件钢块对液压手泵块和驾驶室也是必不可少的, 因为是拧紧液压手泵旋钮, 并确认驾驶室保持加压, 没有泄漏。钢块的正确放置允许驾驶室紧贴膨胀室, 从而在 Mylar 膜片的腔开口上以及驾驶员与膨胀室之间形成所需的强制性密封。
在 MCA 容器提取前的准备过程中, 在 n2 平衡的情况下, 用 21% o2 和 5% CO2 的必要混合物气化 pss,平衡溶液并促进所需的中性生理 ph 值.工作 pss 解决方案21,33,34。
在恒定压力下平衡段, 达到 60分钟21、32、33、34是非常必要的, 因为此步骤允许段在显示最大扩张后收缩。他们的第一次初级加压。这个事件表明自发的音调的发生, 一个属性暗示一个健康的动脉32,33,34。虽然在其他研究中使用了分段平衡的各种压力水平,但33、34、42、这项研究和 mathew 等人的研究 21人、golding 等人的研究都使用了。和 Golding 等人,43将这些片段平衡在50毫米汞柱。虽然平衡收集段的任何地方之间 40 mmHg–100 Mmmhg32允许一定的灵活性和修改的协议的步骤, 一个小时的平衡期内的压力参数最终证实健康继续实验所需的动脉。
在保持这些血管完整的同时, 将大脑从头骨和左、右 MCA 段移除时, 要格外小心, 这或许是整个协议中最关键的一步。用骨头刺穿大脑, 在切除过程中撕裂或严重伸展部分, 或在从头骨中挖出大脑时, 用手术铲子不小心拉扯血管, 最终会导致收获的东西被破坏MCA 的, 导致无法使用的段和停止使用这一组动脉, 最终使整个实验无效的动物。
尽管测量体内撞击或爆炸后收集的 MCA 段中脑血管对扩张或收缩刺激的反应已取得成功, 但该方法并非没有困难和局限性。也许与研究 TBI 对大脑血管循环的影响有关的一个更明显的复杂性是, 将 TBI 对血管的显性影响与各种材料和物质所产生的隐性影响分离。由受伤的大脑产生的元素44。通过体外分析所收获的、灌注的和加压的 mca 的血管收缩和血管舒张反应, 这种想象中的困惑可能会被回避。为了缩短体内大脑动脉在死亡前接触局部排出的实质血管活性物质的时间, 在 TBI 之后直接收集大脑动脉可以降低这种延长暴露的程度影响。对分离性 MCA 的进一步体内研究提出了分析创伤性血管损伤机制的前景, 通过使用特定的受体激动剂和拮抗剂或声誉载体的血管损伤, 不会作为审查有效或作为歧视性的体内。随后, 这种体外方法可与体外接触药物相结合, 以检测产生的肌源性反应 (血管内或血管外药物暴露引起的血管收缩或扩张)。
其他限制包括大致或不耐烦地从收获的大脑中取出 MCA, 这可能导致血管过早撕裂, 从而使其无法使用。此外, 让动物安乐死、血管的收集及其在准备好的 PSS 溶液中的放置之间超过几分钟, 也会否定它们的生存能力。如果执行和遵循得当, 本协议中描述的测试 bTBI 后 MCA 肌原反应的方法从开始到结束需要几个小时, 试图缩短成功所需的时间可能会导致实验失败。然而, 这种方法是在体外完成的, 并使用更具成本效益的仪器和设备比体内高分辨率磁共振成像(mr) 45,46或传统的多普勒超声像。速度测量技术 47,48,49也用于血管研究。
这些发现, 轻度 btbi 损伤与脑扩张反应受损降低的血管内压力可能是血管痉挛6,7和 vsmc 过度收缩50的函数以前报告后的爆炸暴露最终导致发生, 如减少相对脑灌注。此外, 爆炸引起的损伤阻碍了大脑血管的正常扩张反应, 可能会促进进一步减少脑灌注时, 再加上动脉低血压, 在战斗行动中的频繁发生率。
这些结果表明, bTBI 导致机制的改变, 促进动脉血管控制。虽然在损伤后至少一小时观察到动脉肌功能障碍对血管内压降低的反应, 但 bTBI 后急性期的信息仍存在差距。确定哪些物理和生化缺陷损伤的大脑血管和大脑暴露于 bTBI 的原因的重要性, 可以帮助确定治疗水平和/或康复成功的相当直接后, 伤害。
The authors have nothing to disclose.
研究是作为穆迪转化创伤脑损伤研究项目支持的一个小组的一部分完成的, 并从美国陆军医学研究和物资指挥部—-国防部—-颁发了 W81XWH-08-2-0132。
Advanced Blast Simulator (ABS) | Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. | N/A | Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries |
Adult, male, Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | N/A | Experimental animals |
Arteriograph | Living Systems Instrumentation, Inc. | Arteriograph | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Bone rongeurs, large | FST Fine Science Tools | Friedman Rongeur | Brain extraction from skull |
Bone rongeurs, small | FST Fine Science Tools | Boynton Rongeur | Brain extraction from skull |
CaCl2 | Sigma | Calcium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Ear plugs | 3M | Foam Ear Plugs 1100 Class AL | Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine |
Glucose | Sigma | D-[+]-Glucose | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | Isoflurane, USP | Anesthetic |
KCl | Sigma | Potassium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
MgSO4•7H2O | Sigma | Magnesium sulfate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Microforceps | Buxton Biomedical Inc. | Micro Tying Fcps, 180mm | Brain extraction from skull |
Mylar sheets | Texas Art Supply | Mylar | Membrane used for compressed air build-up during blasting |
NaCl | Sigma | Sodium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
NaHCO3 | Sigma | Sodium bicarbonate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Nylon suture | Ethicon | 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Scalpel blade #10 | Bard-Parker | 10 Stainless Steel Surgical Blade | Brain extraction from skull |
Surgical spatula | Delmaks Surgico | Cement Spatula | Brain extraction from skull |
Thermometer | Physitemp Instruments, Inc., | Thermalert Monitoring Thermometer | Monitoring of experimental animal's core body temperature |
Volume ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | Small Animal Ventilator | Constant and steading breathing of the intubated experimental animal |
Water blanket | Gaymar Industries, Inc. | Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad | Maintenance of experimental animal's body temperature |