Qui, presentiamo un protocollo per descrivere i metodi per ex vivo determinazione di reattività vascolare segue una ferita di cervello traumatica esplosione primaria (bTBI) utilizzando segmenti di isolato, pressurizzato, roditore arterioso cerebrale centrale (MCA). bTBI induzione avviene utilizzando un tubo d’urto, noto anche come un dispositivo avanzato simulatore di Blast (ABS).
Anche se ci sono stati studi sugli effetti istopatologici e comportamentali dell’esposizione di scoppio, meno sono state dedicate agli effetti vascolari cerebrali di esplosione. Impatto (cioè, non-esplosione) trauma cranico (TBI) è noto per diminuire pressione autoregolamento nel vasculature cerebrale in sia in esseri umani ed in animali da esperimento. L’ipotesi che la ferita di cervello traumatica blast-indotta (bTBI), come impatto TBI, risultati nella reattività vascolare cerebrale alterata è stata testata misurando le risposte myogenic dilatorie a ridotta pressione intravascolare in roditore arterioso cerebrale centrale (MCA) segmenti da ratti sottoposti a lieve bTBI utilizzando un tubo di shock Blast simulatore avanzato (ABS). Adulti, maschi ratti Sprague-Dawley erano anestetizzati, intubati, ventilati e preparati per bTBI Sham (manipolazione identici e anestesia fatta eccezione per la ferita di scoppio) o lieve bTBI. Ratti sono stati assegnati a caso per ricevere Sham bTBI o lieve bTBI seguita da sacrificio 30 o 60 min post-infortunio. Subito dopo bTBI, raddrizzante volte riflesse di soppressione (RR) sono stati valutati, eutanasia presso i punti di tempo post-lesione è stata completata, il cervello è stato raccolto e i singoli segmenti MCA sono stati raccolti, montati e pressurizzati. Come la pressione intraluminal irrorata attraverso i segmenti arteriosi è stata ridotta a 20 mmHg con incrementi da 100 a 20 mmHg, MCA diametri erano misurati e registrati. Con la diminuzione della pressione intraluminal, MCA diametri costantemente aumentati significativamente di sopra della linea di base nei gruppi Sham bTBI mentre le risposte del dilatatore MCA sono stati ridotti significativamente (p < 0,05) in entrambi i gruppi bTBI come testimoniano i vedenti, più piccolo Diametri MCA registrato per i gruppi di bTBI. Inoltre, la soppressione di RR nei gruppi bTBI era significativamente (p < 0,05) superiore nei gruppi bTBI Sham. MCA di raccolti dalla bTBI di Sham gruppi proprietà vasodilatatrici tipici esposti alle diminuzioni nella pressione intraluminal mentre MCA raccolti a seguito di bTBI hanno esibito significativamente alterata risposte myogenic vasodilatatori ridotta pressione che ha persistito per almeno 60 min dopo bTBI.
Simile a quello risultante dall’impatto (cioè, non-esplosione) TBI, ferita di cervello traumatica blast-indotta (bTBI) è stata associata con danno vascolare cerebrale1 e alterato le risposte compensative vascolare cerebrale alle occorrenze come alterazioni delle pressioni parziali di anidride carbonica (PaCO2)2,3,4 e ossigeno (PaO2)5. Inoltre, l’esposizione di scoppio ha causato il vasospasmo arterioso cerebrale in animali6 e bTBI pazienti7,8. Mentre clinico TBI9 e lesioni fluido-percussioni (FPI)10,11,12 sono associati con le risposte vascolari cerebrali alterate ai cambiamenti nella pressione sanguigna arteriosa (cioè, pressione di autoregolazione)9,10,11,12, permangono incertezze per quanto riguarda gli effetti del bTBI sulla capacità di autoregolazione pressione vascolare cerebrale.
La circolazione cerebrale reagisce alle variazioni di pressione arteriosa sistemica con l’intento di mantenere un continuo di ossigeno e apporto di sostanze nutritive consegnata al cervello metabolicamente attivo13,14,15, 16. Un tipo unico di omeostasi, autoregolamento17,18,19 si verifica quando “un organo mantiene un flusso costante di sangue malgrado i cambiamenti nella pressione sanguigna (aspersione) o da altri stimoli fisiologici o patologici” 20. arterie cerebrali si restringono o si dilatano in risposta a variazioni della pressione sanguigna, l’ossido nitrico (NO), viscosità del sangue, PaCO2 e PaO2, ecc.4,11,16, 21. valutazione della risposta miogenica arteriosa si riferisce a tali contrazioni o dilatazioni. La risposta vascolare miogenica, in primo luogo descritta da Bayliss22 e un meccanismo importante contribuendo alla autoregolamento di CBF, è caratterizzata da vasocostrizione se aumenta la pressione di aspersione e vasodilatazione se diminuisce la pressione di aspersione 14 , 17. questa risposta vascolare è la capacità intrinseca dei tessuti contrattili (ad esempio cellule di muscolo liscio vascolare, VSMC) di rispondere per allungare e/o cambiamenti nel lume e/o parete tensione23,24, 25,26,27,28,29. Quando le arterie sono tese (ad es., durante la pressione intravascolare aumenta), costrizione di VSMC24,25,26,28.
Studi che esaminano le navi di resistenza ex vivo sono comunemente impiegati uno dei due metodi per testare le proprietà farmacologiche e fisiologiche dei vasi di resistenza isolato: il metodo anello-montato e il cannulate, pressurizzato metodo. Il metodo di preparazione anello montato nave comporta due fili passati intraluminally attraverso il segmento di vaso, che tengono il segmento sul posto. Misurazione della quantità di forza applicata sui fili isometricamente sostenuti calibri la stimolazione delle VSMC. Tuttavia, questa tecnica porta con sé alcune riserve, in particolare, le inevitabili danni sorretto dallo strato endoteliale del lume come i fili vengono passati attraverso di essa30 e il variabile grado di stretching sostenuto dal segmento isolato che a sua volta conduce alla distensione di parete di vaso, in ultima analisi che interessano sensibilità dell’imbarcazione a agenti farmacologici31. La metodologia di preparazione cannulate, pressurizzato nave utilizza un arteriograph composto da due camere separate che ogni casa il posizionamento di un arterioso cerebrale centrale (MCA) raccolta da un singolo animale. Una micropipetta viene inserita in ogni estremità del segmento, l’estremità prossimale del segmento è fissato per la micropipetta con punti di sutura e il lume è dolcemente irrorato con una soluzione salina fisiologica (PSS) al fine di eliminare il sangue e altre sostanze. L’estremità distale è quindi garantito con punti di sutura. Transmurale o pressione luminal è impostato sollevando i due serbatoi collegati a ogni pipetta a un’altezza adeguata sopra ogni segmento, ma ad altezze diverse per quanto riguarda le altre32,33,34,35 ,36. Trasduttori di pressione posizionati lungo i bacini e Micropipette forniscono aspersione misure di pressione mentre vasi vengono ingranditi utilizzando un microscopio invertito provvisto di monitor, videocamera e scaler che permette di misurare dell’esterno Diametri MCA. Anche se entrambi i metodi sono preziosi, la metodologia di preparazione nave cannulate, pressurizzato imita meglio e permessi i vasi studiato per essere più vicini a loro in vivo condizioni32,37.
Gli effetti di diversi tipi di impatto (cioè, non-esplosione) TBI su risposte vascolari cerebrali precedentemente sono state studiate in segmenti arteriosi cerebrali21,35,36,38. Utilizzando un simile ex protocollo MCA vivo per vaso raccolta, montaggio e perfusione come descritto nello studio corrente, gli studi più iniziali ottengono successo con loro rispettive indagini i meccanismi associati di disfunzione del sistema vascolare cerebrale dopo TBI. Golding et al.34 ha esaminato le dilatazioni endoteliale mediata nel adulto, maschio lungo Evans ratto MCA seguito TBI severo attraverso lesioni impatto corticale controllato (CCI). In un secondo studio, Golding et al.36 studiato reattività cerebrovascolare a ipotensione o CO2 dopo la raccolta di MCA dai ratti che ha sostenuto una lieve CCI. Yu et al.38 analizzato se le risposte dilatorio migliorata di peroxynitrite spazzini alla ridotta pressione intravascolare in adulti, maschi Sprague-Dawley ratto MCA segmenti sottoposto a dei FPI Mathew et al.21 studiato le risposte myogenic a ipotensione in MCA di raccolte dopo moderato, FPI centrale.
Per meglio indagare l’ipotesi che bTBI, come non-blast TBI, risultati nella reattività vascolare cerebrale alterata, abbiamo testato un meccanismo contribuendo alla autoregolamento compromesso misurando le risposte myogenic dilatorie a ridotta pressione intravascolare ex vivo in isolato, pressurizzati roditore MCA segmenti (Figura 1) raccolti da ratti sottoposti a lieve bTBI utilizzando un modello di filmato shock Blast simulatore avanzato (ABS) (Figura 2 e Figura 3) (vedere Rodriguez et al.39 Tabella 1) che utilizza aria compressa erogata direttamente ad una camera driver per generare Freidlander-come40 sopra e sotto pressione onde (vedere Rodriguez et al.39Figura 1A).
Figura 1 : Posizione delle arterie cerebrali (MCA). Vista ventrale del cervello del ratto evidenziando la posizione del relativo le arterie cerebrali posteriori (PCA), arterie carotiche interne (ICA), arterie carotiche esterne (ECA), arteria basilare (BA) e le arterie carotiche comuni (CCA) di MCA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Avanzato dispositivo di tubo shock Blast Simulator (ABS). L’ABS è usato per produrre la ferita di scoppio primario in tutti gli animali di studio. 1 = camera driver; 2 = camera di espansione; 3 = camera di esemplare; 4 = soppressore onda riflessa; stella gialla = vassoio porta campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Come con tutti i protocolli e le istruzioni, è indispensabile che alcuni passaggi per il protocollo in questo studio particolare sono seguiti nel modo più accurato e più precisamente possibile. Dopo l’intubazione iniziale del ratto è importante confermare che sta respirando costantemente e senza difficoltà. Erroneamente inserimento del tubo endotracheale nell’esofago invece la trachea si tradurrà in raspare, difficili respiri, sanguinamento e la successiva travolgente del ratto a causa della carente anestetico consegna ai polmoni.
Quando i fogli di membrana di mylar di nastratura sopra il centro dell’apertura tra la camera di driver e di espansione, è imperativo che i fogli sono centrati e coprono l’intera apertura39,41. Disallineati i fogli sopra l’apertura si tradurrà in perdite d’aria dalla camera di driver, una goccia nella pressione richiesta per scoppio-potenziale di membrana e la negazione dell’amministrazione della ferita di scoppio. Montaggio saldamente il blocco in acciaio accessorio e situare correttamente contro la pompa idraulica manuale camera di blocco e il driver è anche essenziale come sta stringendo la manopola di pompa idraulica manuale e confermando la camera driver rimane pressurizzato senza perdite. Corretto posizionamento del blocco d’acciaio permette la camera driver chiudere saldamente contro la camera di espansione, creando così il sigillo obbligatorio richiesto sopra la camera di apertura per i fogli di membrana di Mylar e tra la camera di driver e di espansione.
Durante i preparativi prima le estrazioni di vaso MCA, gassazione PSS con la miscela necessaria del 21% O2 e 5% CO2 in un equilibrio di N2 equilibra la soluzione e facilita il pH fisiologico neutro richiesto necessario per un lavorando PSS soluzione21,33,34.
Equilibrare i segmenti a pressione costante per 60 min21,32,33,34 è estremamente obbligatorio come questo passaggio permette i segmenti costrizione segue che una dilatazione massima visualizzata durante loro primo pressurizzazione primarie. Questo evento dimostra l’avvenimento di tono spontaneo, una proprietà indicativa di un’arteria sana32,33,34. Anche se i livelli di pressione assortiti di equilibramento di segmento sono stati utilizzati in altri studi33,34,42, questo studio e quelli di Mathew et al.21, Golding et al.35 e Golding et al.43 equilibrati i segmenti a 50 mmHg. Mentre vengono raccolti segmenti ovunque tra 40 mmHg – 100 mmHg32 consente alcune flessibilità e modifica per il passo del protocollo, un periodo di equilibrazione ore all’interno di quei parametri di pressione in definitiva conferma sano arterie necessarie per la continuazione dell’esperimento.
Prendendo estrema cautela quando si rimuove il cervello dal cranio e i segmenti MCA di sinistra e destro dal cerchio di Willis, mantenendo intatte quelle navi è forse la fase più critica del protocollo intero. Perforando il cervello con l’osso Pinze ossivore, strappo o stiramento grave dei segmenti durante la rimozione o accidentalmente tirando i vasi con la spatola chirurgica quando il cervello dal cranio di scavo si tradurrà in definitiva distruzione del raccolto MCA, causando segmenti inservibili e interrotto l’uso di tale sistema di arterie, in ultima analisi, invalidare l’intero esperimento per quell’animale.
Anche se le risposte vascolari cerebrali agli stimoli dilatori o constrictory in MCA segmenti ex vivo di misurazione raccolti dopo l’impatto o esplosione TBI in vivo ha dato il successo, la metodologia non è senza la sua difficoltà e/o limitazioni. Forse uno delle più percepibile complessità legata con esaminare le conseguenze di TBI sulla circolazione del vasculature cerebrale sta staccando gli effetti espliciti di TBI sui vasi dagli effetti impliciti sostenuti a causa di vari materiali e elementi generati dal cervello danneggiato44. Questa perplessità immaginabile può potenzialmente essere eluso analizzando ex vivo le reazioni vasoconstrictory e vasodilatatrice del raccolto, irrorati e/o pressurizzato di MCA. Nel tentativo di ridurre la durata del tempo che le arterie cerebrali in vivo sono esposti a scaricato localmente parenchimatico vasoattivo materiale prima della morte, la collezione delle arterie cerebrali direttamente dopo TBI può diminuire il grado di tale esposizione prolungata effetti. Ex vivo studi di MCA isolato inoltre presentare la prospettiva di analisi di meccanismi della ferita traumatica vascolare attraverso l’uso di agonisti del recettore particolare e antagonisti o veicoli reputati di lesione vascolare che non potrebbe permettersi controllo come in modo efficiente o come discriminatorio in vivo. Successivamente, questo ex vivo metodo può essere combinato con ex vivo l’esposizione a farmaci per testare le risposte myogenic risultante (vasocostrizione o dilatazione del segmento del vaso a causa di esposizione al farmaco intravascolare o extravascolare).
Altre limitazioni sono approssimativamente o con impazienza rimozione di MCA dal cervello raccolto che può provocare la prematura lacerazione dei vasi, svuotando così il loro uso. Inoltre, lasciando più di un paio di minuti consentiti tra eutanasia dell’animale, raccolta dei vasi e la loro collocazione nella soluzione preparata PSS può anche negare loro vitalità. Quando correttamente eseguito e seguito, i metodi descritti nel presente protocollo per testare le risposte myogenic di MCA dopo bTBI richiede diverse ore dall’inizio alla fine e tentativi di limitare la lunghezza del tempo necessario per il successo possono provocare sperimentale fallimento. Tuttavia, questo metodo è fatto in vitro e utilizza considerevolmente più conveniente strumentazione e attrezzature rispetto a risonanza magnetica ad alta definizione in vivo (SIG)45,46 o l’ecografia convenzionale di Doppler imaging / velocimetrici tecniche47,48,49 che vengono impiegate anche per studi di nave.
Questi risultati che bTBI lieve lesione è associata con le risposte dilatorie cerebrale alterate alla ridotta pressione intravascolare potenzialmente potrebbero essere una funzione del vasospasmo6,7 e VSMC hyperconstriction50 precedentemente segnalati dopo l’esposizione di scoppio sfociare in occorrenze come ridotta perfusione cerebrale relativo. Inoltre, il danno indotto da esplosione che ostacolano le reazioni normali dilatorie del vasculature cerebrale possibilmente potrebbe promuovere ulteriori riduzioni nell’aspersione cerebrale quando combinato con ipotensione arteriosa, un frequente incidenza durante le operazioni di combattimento.
Questi risultati indicano che bTBI provoca un cambiamento per i meccanismi che agevolino il controllo vascolare arteriosa. Anche se sono stati osservati compromissione vascolare cerebrale acuto-fase di risposta miogenica arteriosa per riduzione di pressione intravascolare di alberino-ferita almeno un’ora, ci restano lacune nelle informazioni che circondano la fase acuta dopo bTBI. L’importanza di identificare quali lesioni fisiche e biochimiche carenze al sistema vascolare cerebrale e l’esposizione del cervello a bTBI cause potrebbero aiutare a determinare il livello di successo terapeutico e/o riabilitativo abbastanza immediatamente dopo la lesione.
The authors have nothing to disclose.
Gli studi sono stati completati come parte di un team supportato da The Moody Project per la ricerca di ferita di cervello traumatica traslazionale e premio W81XWH-08-2-0132 dalla US Army Medical Research e dal comando materiale – dipartimento della difesa.
Advanced Blast Simulator (ABS) | Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. | N/A | Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries |
Adult, male, Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | N/A | Experimental animals |
Arteriograph | Living Systems Instrumentation, Inc. | Arteriograph | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Bone rongeurs, large | FST Fine Science Tools | Friedman Rongeur | Brain extraction from skull |
Bone rongeurs, small | FST Fine Science Tools | Boynton Rongeur | Brain extraction from skull |
CaCl2 | Sigma | Calcium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Ear plugs | 3M | Foam Ear Plugs 1100 Class AL | Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine |
Glucose | Sigma | D-[+]-Glucose | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | Isoflurane, USP | Anesthetic |
KCl | Sigma | Potassium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
MgSO4•7H2O | Sigma | Magnesium sulfate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Microforceps | Buxton Biomedical Inc. | Micro Tying Fcps, 180mm | Brain extraction from skull |
Mylar sheets | Texas Art Supply | Mylar | Membrane used for compressed air build-up during blasting |
NaCl | Sigma | Sodium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
NaHCO3 | Sigma | Sodium bicarbonate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Nylon suture | Ethicon | 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Scalpel blade #10 | Bard-Parker | 10 Stainless Steel Surgical Blade | Brain extraction from skull |
Surgical spatula | Delmaks Surgico | Cement Spatula | Brain extraction from skull |
Thermometer | Physitemp Instruments, Inc., | Thermalert Monitoring Thermometer | Monitoring of experimental animal's core body temperature |
Volume ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | Small Animal Ventilator | Constant and steading breathing of the intubated experimental animal |
Water blanket | Gaymar Industries, Inc. | Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad | Maintenance of experimental animal's body temperature |