Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Uylissa A. Rodriguez; Yaping Zeng; Margaret A. Parsley; Bridget E. Hawkins; Donald S. Prough; Douglas S. DeWitt

doi:10.3791/58792

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Neuroscience

Efectos de Neurotrauma inducido ráfaga en roedor a presión media de las arterias cerebrales

Published: April 01, 2019

doi:

10.3791/58792

Uylissa A. Rodriguez², Yaping Zeng², Margaret A. Parsley², Bridget E. Hawkins², Donald S. Prough², Douglas S. DeWitt²

¹Charles R. Allen Research Laboratories, Department of Anesthesiology,University of Texas Medical Branch, ²The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research,University of Texas Medical Branch

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para describir métodos ex vivo determinación de la reactividad vascular después de una explosión primaria una lesión cerebral traumática (bTBI) con segmentos de roedores, aislado y a presión arterial cerebral media (MCA). bTBI inducción se logra mediante un tubo de descarga, también conocido como un dispositivo simulador de explosión avanzado (ABS).

Abstract

Aunque se han realizado estudios sobre los efectos histopatológicos y comportamiento de la exposición de la ráfaga, pocos se han dedicado a efectos vascular cerebral de la ráfaga. Impacto (es decir,, no-blast) traumatismo craneoencefálico (TCE) se conoce para disminuir la presión de autorregulación de la vasculatura cerebral en humanos y animales de experimentación. La hipótesis de que ráfaga-inducida por traumatismo craneoencefálico (bTBI), como impacto LCT, resulta en la reactividad vascular cerebral deteriorada se evaluó midiendo las respuestas dilatorias miógenas a presión intravascular reducida en roedor arterial cerebral media (MCA) segmentos de ratas sometidas a bTBI suave utilizando un tubo de descarga de simulador de explosión avanzado (ABS). Ratas Sprague-Dawley adultas, macho fueron anestesiadas, intubadas, ventiladas y preparadas para bTBI simulada (manipulación idéntica y anestesia salvo lesión por explosión) o bTBI suave. Las ratas fueron asignadas aleatoriamente a recibir bTBI simulada o bTBI suave seguido de sacrificio 30 o 60 min después de la lesión. Inmediatamente después bTBI, righting reflejas tiempos de supresión (RR) se evaluaron, se completó la eutanasia en los puntos de tiempo después de la lesión, el cerebro fue cosechado y los segmentos individuales de MCA fueron recogidos, montados y a presión. Como la presión intraluminal perfundida a través de los segmentos arteriales se redujo en 20 mmHg incrementos de 100 a 20 mmHg, diámetros MCA fueron medidos y registrados. Con la disminución de la presión intraluminal, MCA diámetro aumentado significativamente por encima de la basal en los grupos de bTBI simulada mientras que las respuestas de dilatador MCA se redujeron significativamente (p < 0.05) en ambos grupos bTBI evidenciada por el deterioro, más pequeño Diámetros MCA registran para los grupos bTBI. Además, la supresión de la RR en los grupos bTBI fue significativamente (p < 0.05) más alta que en los grupos de bTBI simulada. MCA de recogida de la farsa bTBI grupos exhiben propiedades vasodilatadoras típico a disminuciones en la presión intraluminal mientras que de MCA después bTBI exhibida significativamente deterioraron miógenas respuestas vasodilatadoras reducido la presión que persistió durante al menos 60 minutos después bTBI.

Introduction

Similares que resulten de impacto (es decir,, no-blast) TCE, lesión de cerebro traumática ráfaga-inducida (bTBI) ha sido asociada a lesión vascular cerebral¹ y deteriorada cerebrales vasculares respuestas compensatorias a las ocurrencias como alteraciones en la presión parcial de dióxido de carbono (PaCO₂)²^,³^,⁴ y el oxígeno (PaO₂)⁵. Además, exposición de explosión ha causado vasoespasmo arterial cerebral en animales⁶ y bTBI pacientes⁷^,⁸. Mientras que los clínicos TBI⁹ y lesiones líquido-percusión (FPI)¹⁰^,¹¹^,¹² están asociados con deterioro cerebrales vasculares respuestas a los cambios en la presión arterial (es decir,, presión de autorregulación)⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹², sigue habiendo incertidumbres en cuanto a los efectos de bTBI sobre la capacidad de autorregulación de la presión vascular cerebral.

La circulación cerebral reacciona a las variaciones en la presión arterial sistémica con la intención de mantener una continua oxígeno y nutrientes fuente al cerebro metabólicamente activos¹³^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶. Un único tipo de homeostasis, autorregulación¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ se produce cuando “un órgano mantiene un flujo sanguíneo constante a pesar de cambios en la presión arterial (perfusión) u otros estímulos fisiológicos o patológicos”²⁰. arterias cerebrales constriñen o dilatan en respuesta a las variaciones en la presión arterial, el óxido nítrico (NO), viscosidad de la sangre, PaCO₂ y PaO₂, etc.⁴^,¹¹^,¹⁶^, ²¹. respuesta miógena arterial se refiere a las contracciones o dilataciones. La respuesta vascular miógena, primero descrita por Bayliss²² y un mecanismo importante que contribuye a la autorregulación de la CBF, se caracteriza por si la presión de perfusión aumenta la vasoconstricción y la vasodilatación si disminuye la presión de perfusión ¹⁴ ^, ¹⁷. esta respuesta vascular es la capacidad inherente de los tejidos contráctiles (tales como células de músculo liso vascular, Coevolución) responden al estiramiento o cambios en el lumen o la pared tensión²³^,²⁴^, ²⁵²⁶^,de^,²⁷^,²⁸^,²⁹. Cuando las arterias se estiran (e.g., en la presión intravascular aumenta), Coevolución constrict²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁸.

Estudios que examinan los vasos de resistencia ex vivo se utiliza uno de dos métodos de prueba de las propiedades farmacológicas y fisiológicas de los vasos de resistencia aislada: el método de montado en anillo y canulado, método presurizado. El método de preparación del buque montado en anillo consiste en dos cables pasados intraluminally con el segmento de vaso, que sostienen el segmento en su lugar. Midiendo la cantidad de fuerza aplicada en los cables isométrica sostenidos indicadores de la estimulación de la Coevolución. Sin embargo, esta técnica lleva consigo ciertas reservas, en particular, el inevitable daño sufrido por la capa endotelial de la luz como los cables pasan a través de ella³⁰ y el grado variable de estiramientos sostenidos por el segmento aislado que a su vez conduce a distensión de la pared del vaso, en última instancia, que afectan a la sensibilidad del buque a agentes farmacológicos³¹. La metodología de preparación del recipiente a presión, canulado utiliza un arteriograph compuesto de dos cámaras separadas que cada casa la colocación de una arterial cerebral media (MCA) de un solo animal. Una micropipeta se inserta en cada extremo del tubo, el extremo proximal del segmento se sujeta a la micropipeta con suturas y la luz suavemente se perfunde con una solución salina fisiológica (PSS) para eliminar la sangre y otras sustancias. El extremo distal luego se fija con suturas. Transmural o presión luminal se encuentra levantando los dos embalses conectados a cada pipeta a una altura adecuada por encima de cada segmento pero a diferentes alturas con respecto a los otros³²^,³³^,³⁴^,³⁵ ^,³⁶. Transductores de presión, colocados a lo largo de los embalses y Micropipetas proporcionan perfusión la medición mientras que los vasos se potencian usando un microscopio invertido equipado con un monitor, cámara de vídeo y escalador, lo que permite medición del externo Diámetros MCA. Aunque ambos métodos son útiles, la metodología de preparación del recipiente a presión, canulado imita mejor y permite los vasos investigados para estar más cerca de su en vivo condiciones³²^,³⁷.

Los efectos de diferentes tipos de impacto (es decir,, no-blast) TBI en respuestas vasculares cerebrales han estudiado previamente en segmentos arteriales cerebrales²¹^,³⁵^,³⁶^,³⁸. Con un similar ex vivo protocolo MCA para colección de vasos, montaje y como se describe en el presente estudio de la perfusión, estudios anteriores obtuvieron éxito con sus respectivas investigaciones en los mecanismos asociados de la disfunción de la vasculatura cerebral después de TBI. Golding et al³⁴ examinado endotelial mediada por dilataciones en adulto, macho Long-Evans rata MCA tras TCE severo debido a una lesión de impacto cortical controlado (CCI). En un segundo estudio, Golding et al.³⁶ investigado reactividad cerebrovascular hipotensión o CO₂después de la cosecha de MCA de ratas que un CCI suave. Yu et al.³⁸ analizados si peroxinitrito carroñeros mejor dilatorias las respuestas para reducción presión intravascular en adultos, macho Sprague-Dawley rata MCA los segmentos sometidos a FPI mientras Mathew et al²¹ estudiaron respuestas miógenas a hipotensión en MCA de cosechadas después de moderada, FPI central.

Para investigar mejor la hipótesis eso bTBI, como ráfaga no TBI, resultados en la reactividad vascular cerebral deteriorada, probamos un mecanismo contribuyendo a la autorregulación comprometida mediante la medición de respuestas dilatorias miógenas a presión intravascular reducida ex vivo en aislado y a presión roedores MCA segmentos (figura 1) de ratas sometidas a bTBI suave usando un modelo de tubo de descarga de simulador de explosión avanzado (ABS) (figura 2 y figura 3) (ver Rodríguez et al³⁹ Tabla 1) que utiliza aire comprimido entregado directamente a una cámara controlador Freidlander como⁴⁰ sobre y debajo de la presión de generar olas (ver Rodríguez et al³⁹figura 1A).

Figura 1 : Ubicación de la arteria cerebral media (MCA). Vista ventral del cerebro de rata, destacando la ubicación de la MCA en relación con las arterias cerebrales posteriores (ACP), arterias carótidas internas (ACI), arterias carótidas externas (CEPA), (BA) de la arteria basilar y arterias carótidas comunes (CCA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Avanzado dispositivo de tubo de descarga simulador de explosión (ABS). El ABS se utiliza para producir lesión por explosión primaria en todos los animales de estudio. 1 = sala de conductor; 2 = cámara de expansión; 3 = cámara de muestra; 4 = supresores de onda reflejada; estrella amarilla = bandeja de muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad del rama médico de Texas, una asociación para la evaluación y acreditación del cuidado de animales de laboratorio (AAALAC) acreditados instalaciones. 1. animal preparación para lesión por explosión de ABS Encender ventilador mecánico volumen roedores y establecer la frecuencia de respiración entre 40-45 respiraciones por minuto. Interruptor termostático controlado ON manta calentadora y un cojín azul de la cinta sobre él. Sujete la manguera de ventilador a ventilador. Se reúnen trineo de intubación endotraqueal, laringoscopio, pinzas largo recogidas, estilete, tubo endotraqueal, y un hisopo de algodón empapado con 0,05 mL de 1% lidocaína HCl. organizar en el cojín azul. Confirman que roedores anestésico “burbuja” cámara, ventilador, cámara de aire y el isoflurane cámara mangueras son firmemente conectadas y conectadas a su respectivo conector o zócalo. El clip de compartimiento de burbuja anestésica debe estar abierto; la abrazadera del ventilador debe ser cerrada. En la cámara de aire, gire la perilla de aire de la habitación a 2 L/min y la perilla para el oxígeno a 1 L/min. Encienda el isoflurano y ajustar la perilla al 4% de mezcla de volumen. Iniciar un temporizador y un adulto joven (≈3 meses), la rata Sprague-Dawley macho (350 – 400 g) en la cámara de burbujas de anestésica durante 4 – 6 minutos. Pesar de rata en la marca de 2 minutos. Confirmar la rata está totalmente anestesiada pellizcando suavemente los dedos de la patas traseras. Si no se observa la retirada de la pata, reducir el aire y ajuste la perilla de 1 L/min, oxígeno a 0,4 L/min y el isoflurano al 2% de mezcla de volumen. Encienda el monitor de la temperatura rectal de un teletermómetro. ABRIR la abrazadera para el ventilador y cierre la pinza a la cámara de burbujas de anestésica. Sacar rata del anestésico compartimiento de burbuja y en trineo de intubación endotraqueal. Rata de intubar. Colocar el laringoscopio en la boca del animal, utilizar pinzas largo recogidas para posicionar la lengua fuera del camino, punta de torunda de algodón empapada en lidocaína esponja a lo largo dentro de la garganta y suavemente inserte el estilete que contiene el tubo endotraqueal en la tráquea de rata. Una vez intubado, inserte el extremo de la manguera del ventilador en el extremo exterior del tubo endotraqueal y observar y confirmar que la rata está respirando constantemente y sin dificultad. Atar el tubo endotraqueal en lugar teniendo cuidado de que la lengua es libre de nudo. Aplique vaselina blanca a un teletermómetro rectal sonda e inserte directamente debajo de la cola. Retire la bandeja de muestras ABS de la cámara de muestra y colocar debajo de la lámpara de calor para calentamiento antes de la colocación de la rata en la bandeja. Afeitarse la parte superior del cuero cabelludo de la rata a partir sobre los ojos y hasta entre las orejas. Corte un tapón de oído de espuma de tamaño estándar en dos mitades idénticas con las tijeras. Desde el centro de la base del enchufe y corte recto hasta la punta redondeada. Inserte un trozo a la mitad en cada punta de oído primero por el canal de oído hasta que hace contacto con la membrana timpánica. Monitorizar temperatura rectal. Una vez que se alcance una temperatura de 37 ° C, la rata está lista para ser cargado en la bandeja de muestras ABS. Asegure la rata en la bandeja de muestras ABS. Quite la manguera del ventilador del tubo endotraqueal y rápidamente, pero suavemente Deslice la rata en el extremo superior de la bandeja, guiando suavemente la cabeza a través del soporte para abrir y el collarín de goma. Vuelva a insertar la manguera del ventilador de nuevo en el tubo endotraqueal, comprobar el manguito de goma para asegurarse de que está bien, pero no firmemente alrededor del cuello y comprobar que la rata está colocando en una posición prona lateral (figura 3). Apague el isoflurano y retire la manguera del ventilador del tubo endotraqueal. Cerradura y asegure la bandeja de muestras ABS con la rata anestesia en la cámara de muestras ABS. Suavemente pellizco trasero de la pata los pies con unas pinzas largas cada 3 s, hasta que se produce una respuesta de reflejo de retirada. 2. preparación del dispositivo de explosión ABS y Blast-TBI inducción Nota: Pasos de protocolo 2.1-2.10 normalmente se completan al mismo tiempo como pasos 1.1 – 1.22 por lo que el ABS está listo para el derecho de administración de lesión de ráfaga después de que la rata es cargada y asegurada en la cámara de muestra. Afloje la perilla de la bomba (figura 4A) mano hidráulica para permitir cualquier aire atrapado escape del compartimiento del conductor (figura 4B) y suelte la cámara de su sello. Afloje las tuercas de la tapa (figura 4C) de las barras del tornillo (figura 4D) rodeando el compartimiento del conductor y deslice la cámara a la izquierda y de la cámara de expansión (figura 4E). Eliminar completamente las dos barras de tornillo y sus correspondientes tuercas ubicadas en la parte superior de la cámara de conductor con el fin de permitir la colocación de las hojas de mylar entre el conductor y la cámara de expansión. Pila y cinta junto a lo largo el borde superior cuatro precortado y medido (30 cm de longitud, 20 cm de ancho, 0,004 pulg. densamente) hojas de mylar (formando una mylar ‘ membrana’) usando un trozo de 2.54 cm de cinta de enmascarar. Con un segundo pedazo de cinta, cinta firmemente el borde superior de la membrana de mylar en la parte superior de la cámara de expansión y en el centro de la abertura entre los compartimientos del conductor y la expansión (figura 4F). Asegure la cámara controlador contra la membrana de mylar sustituyendo a las dos barras de tornillo en la parte superior de la cámara y apretar a mano todas las tuercas que rodea la cámara. Situar el bloque de acero accesorio contra la mano hidráulica bomba bloque y controlador hasta que ajuste bien. Apriete la perilla de la bomba de mano hidráulica y confirmar que la cámara controlador permanece a presión con no fugas observando un umbral constante presión en el manómetro hidráulico. Abra el archivo de adquisición de gatillo que registra huellas de presión de dispositivo ABS explosión en el equipo de dispositivo de explosión ABS. Afloje (figura 4G) perilla principal del tanque aire comprimido suficiente para abrir un poco las vías respiratorias. Haga funcionar la bomba de mano hidráulica hasta que el indicador llegue a la flecha roja que indica un nivel de presión de cámara deseado de ≈5, 000 psi. Asegure y coloque el animal anestesiado en la bandeja de muestras ABS (figura 4H) en una posición prona lateral (figura 3) y bloquear la bandeja de muestras en la cámara de muestras ABS (figura 4). Una Cierva pinch suavemente la pata con pinzas largo cada 3 s, hasta que se produce una respuesta de reflejo de retirada. Haga clic en Inicio en la página de adquisición abiertos en el equipo de dispositivo de explosión ABS. Una vez que aparezca la ventana de ‘Acquisitioning’ en la pantalla, pulse y mantenga pulsado el gatillo de dispositivo ABS ráfaga hasta que la explosión se apague, ruptura de la membrana de mylar y la administración de la lesión por explosión ABS (20,9 psi ±1.14, 138 kPa ±7.9) a la rata. Inmediatamente después de la explosión detona, iniciar un segundo contador de tiempo para realizar un seguimiento de cuánto tiempo (en min y s) transcurrido después de la lesión. Quite la rata de la bandeja de muestras ABS y regresar a la almohadilla azul y cobija, colocarlo totalmente en su parte posterior para la evaluación de la supresión del refleja de enderezamiento. Registrar el tiempo de retorno del reflejo del adrizamiento. Observando el segundo temporizador, documento en min y s la longitud del tiempo posterior a la lesión que se necesita para que la rata al rollo de su espalda a su estómago tres sucesiva veces. Volver la rata a la cámara de burbujas de anestésica. Afloje la perilla de la bomba de mano hidráulica para permitir controlador cámara aflojando y movimiento. Apriete la perilla principal del tanque de aire comprimido para cerrar la vía aérea. Figura 3 : Colocación de rata en bandeja de muestra del ABS y el interior ABS Dirección y orientación de los animales de estudio dentro de la ABS. Cuando se coloca en el ABS, el animal está en una posición prona transversal con la superficie dorsal de la cabeza perpendicular a la dirección de la onda de choque (flechas rojas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : Dispositivo de tubo de descarga simulador de explosión avanzado (ABS) pdf. Principales componentes del ABS. A = bomba de mano hidráulica; B = cámara de conductor; C = las tuercas; D = las barras del tornillo; E = cámara de expansión; F = ubicación de la colocación de la membrana de mylar; G = botellas de aire comprimido; H = bandeja de muestra; I = cámara de muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. preparación de roedores MCA PSS solución Nota: Pasos de protocolo 3.1-3.3 normalmente se completan al mismo tiempo como pasos 1.1 – 1.22 tener la solución PSS está listo para usar. Preparar y mezclar una solución salina fisiológica 1.000 mL (PSS) de la siguiente composición y concentraciones: 130 mM NaCl; 4,7 mM de KCl; 1,17 mM MgSO4∙7H2O; glucosa de 5 mM; 1,5 mM CaCl2; 15 mM NaHCO3. Equilibrar el PSS con una mezcla de gas de 21% O2 y 5% CO2 en un equilibrio de N2. La solución está lista cuando el pH 7.4.Nota: Todos los gases se obtienen de cilindros de gas comprimido en las concentraciones mencionadas. Llenar las botellas de depósito y el tubo con solución preparada de PSS y enfríe la solución restante. 4. extracción de segmentos de roedores MCA Después de documentar la longitud del tiempo righting reflex, volver la rata a la cámara de burbujas de anestésica. CIERRE la pinza al ventilador y abra la pinza a la cámara. Gire el isoflurano a 4% de mezcla de volumen y mantener a la rata en la cámara durante 2-3 min hasta profundamente anestesiados. Una vez que la rata está anestesiada, abra la abrazadera para el ventilador y cierre la pinza a la cámara de burbujas de anestésica. Reducir el isoflurano al 2% de mezcla de volumen y sacarlo de la cámara de burbujas. Lo coloque en su estómago en la cobija y vuelva a insertar el extremo de la manguera del ventilador al extremo exterior del tubo endotraqueal. Mantener la ventilación mecánica a una tasa de respiración entre 40-45 respiraciones por minuto y anestesia al 2% de mezcla de volumen por 30 o 60 min inmediatamente post-bTBI lesiones. Después de que sea el 30 o 60 min tiempo de supervivencia, aumentar el isoflurano al 4% de mezcla de volumen y anestesiar profundamente durante 5 – 6 minutos inmediatamente eutanasia por decapitación con una guillotina de roedor específico.Nota: En estos experimentos, mantuvimos los animales anestesiados y ventilación mecánica tras el retorno de enderezamiento reflejo hasta la decapitación. Si el estudio requiere más puntos de tiempo de supervivencia, analgésicos deben ser administrados a los animales antes de la aparición de la anestesia. Delicadamente saque el cerebro del cráneo. Utilice una hoja de bisturí #10 para hacer una central, incisión de 1,5 pulgadas vertical, profunda de hueso de la parte superior del cuero cabelludo afeitado hasta el cóndilo occipital. Usar gubias hueso pequeño para abrir y separar la piel del cuero cabelludo del hueso del cráneo. Utilizar gubias hueso grande para cortar y extraer el occipital, interparietales y mitad inferior de los huesos frontales incorporados el cerebro. Use una espátula quirúrgica para excavar cuidadosamente el cerebro fuera del cráneo una vez que el cerebro es de alrededor del hueso.Nota: Tome precauciones extremas cuando se separa el cerebro del cráneo que no para tirar innecesariamente, tirón o tire el delicado MCA segmentos de la pared craneal. Depositar el cerebro cosechado en la solución PSS refrigerada contenida en un vaso pequeño de Petri que descansa directamente sobre un bloque de hielo sólido. Retire con cuidado tanto el principio de MCA de izquierda y derecho en el círculo de Willis. Continuar eliminando el segmento dorsal y lateralmente para aproximadamente 4-5 mm. Limpie cuidadosamente los segmentos MCA recogidos de aproximadamente 4 – 5 mm de longitud de cualquier tejido conectivo mediante micro-pinzas. Monte de la MCA en el arteriograph. Canule el extremo proximal de cada segmento con la primera micropipeta de vidrio (diámetro ≈70 μm) y asegurarlo con una sutura de nylon 10-0. Perfusión suavemente el lumina con PSS para quitar cualquier sangre residual y otros contenidos de la luz. Canule la parte distal de cada segmento con la micropipeta segundo sin estirar el segmento MCA y asegurarlo con una sutura de nylon 10-0. Después del exitoso montaje del segmento MCA, coloque la cámara sobre el escenario de un microscopio invertido para un aumento de los vasos. El microscopio está equipado con una cámara de video, monitor y un escalador video calibrado con un micrómetro óptico para la medición del diámetro arterial. Llenan de cada segmento y lo circundantes baño arteriograph PSS circulado continuamente calentados cuando están a temperatura ambiente y 37 ° C y equilibrado con la mezcla de gas de 21% O2 y 5% CO2 en un equilibrio de N2. Equilibre los segmentos MCA a una presión de 50 mmHg durante 60 min levantando las botellas de depósito conectadas a las Micropipetas a una altura adecuada por encima de los segmentos. Transductores de presión situados entre las botellas de depósito y Micropipetas evaluará la presión transmural en el segmento MCA que indica cuando se alcanza la presión deseada de mmHg 50. Después de la conclusión del periodo de equilibrio, aumentar la presión intravascular a 100 mmHg, colocando las botellas de depósito en diferentes alturas. Entregar 30 mM K+ (para la confirmación de la contracción de los vasos) a través de la solución luminal y medir los diámetros arteriales. Aproximadamente 10 minutos más tarde entregar 10-5 M Ach (por dilatación de los vasos) y medir el diámetro arterial. Examinar las respuestas dilatorias de buque. Bajar las botellas de depósito para reducir la presión intravascular de 100 mmHg de 80 mmHg. Permitir que los segmentos de la MCA se equilibren para diámetros arteriales de la medida de 10 minutos. Reducir la presión intravascular de 80 mmHg a 60 mmHg. Permitir que los segmentos de la MCA se equilibren para diámetros arteriales de la medida de 10 minutos. Reducir la presión intravascular de 60 mmHg a 40 mmHg. Permitir que los segmentos de la MCA se equilibren para diámetros arteriales de la medida de 10 minutos. Reducir la presión intravascular de 40 mmHg a 20 mmHg. Permitir que los segmentos de la MCA se equilibren para diámetros arteriales de la medida de 10 minutos.

Representative Results

Sobrepresión bTBI media para todos los animales de estudio fue ±1.14 20,9 psi (138 kPa ±7.9). La duración promedio de enderezamiento supresión del reflejo (RR) para ratas sometidas a exposición ABS bTBI shockwave (5,37 min ±2.1) no fue significativamente mayor (p = 0.36, bTBI vs sham) que en el grupo sham (5,10 min 1,6). En ambos el 30 y 60 min simulado grupos, diámetros MCA aumentaron por encima de la línea de base como presión intraluminal se redujo de 100 a 20 mmHg. En comparación con sus correspondientes grupos de sham, las respuestas dilatorias MCA a la continua impusieron reducción en la presión intravascular en los 30 min observado (p = 0,01, bTBI vs impostor) y 60 min (p = 0,02, bTBI vs sham) ABS bTBI grupos fueron redujo significativamente después de la exposición de la ráfaga (figura 5). Para una discusión más detallada de estos resultados, véase Rodríguez et al39. Estos estudios revelaron que bTBI suave deteriorada significativamente las respuestas cerebral compensatoria dilatador a presión intravascular reducida en 30 y 60 min después bTBI suave mientras que los niveles de ondas de choque suave utilizado en estos estudios dio lugar a la duración de los segmentos MCA supresión de RR (< 30 s) similares a los de las ratas sham heridos. Análisis estadísticos se realizaron con el software. La respuesta miogénica a cambios en la presión intravascular se evaluó mediante el cálculo de porcentaje de cambio de referencia (100 mmHg) para cada nivel de la presión intraluminal (80, 60, 40 y 20 mmHg). T-pruebas estudiante se utilizaron para evaluar las diferencias entre las instantáneas de grupo bTBI y farsa. Diferencias en las respuestas de dilatador MCA entre grupos bTBI y farsa fueron evaluadas utilizando el test de comparaciones múltiples de una Dunnett repetidos análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y prueba de Bartlett para igual variación. Debido a la reducción en potencia estadística que resulta de la prueba repetida, las comparaciones en cada punto específico de la presión en el MCA experimentos (e.g., entre 80 y 100 mmHg, o entre 40 y 60 mmHg, etc.) no se realizaron. Significado fue aceptado en el p ≤ 0.05 nivel. Todos los datos en el texto, referencia de la tabla y figura se expresa como ± errores estándar de los medios (SEM). Figura 5 : Efectos de bTBI sobre las respuestas de la arterial cerebral media (MCA) a presión intravascular reducida. Respuestas del dilatador a la progresiva reducción en la presión intravascular exhibió respuestas vasodilatadoras deterioradas y se redujeron significativamente en los 30 min (p = 0,01, bTBI vs impostor) y 60 min (p = 0,02, bTBI vs impostor) bTBI grupos (n = 6/Grupo) después de la exposición de la ráfaga frente a ambos grupos de tratamiento simulado (n = 12). En ambos el 30 y 60 min simulado grupos, diámetros MCA aumentaron por encima de la línea de base como presión intraluminal se redujo de 100 a 20 mmHg. Valores se trazan como medios ± SEM. *p < 0.05 vs impostor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Como con todos los protocolos y las instrucciones, es imperativo que ciertos pasos para el protocolo de este estudio en particular son seguidos con la mayor exactitud y mayor precisión posible. Después de la intubación inicial de la rata es importante confirmar que está respirando constantemente y sin dificultad. Por error insertando el tubo endotraqueal en el esófago en lugar de la tráquea resultará en áspero, difícil respiración, sangrado y la posterior incitadora de la rata debido a la deficiente entrega de anestésico a los pulmones.

Cuando grabar las hojas de la membrana de mylar sobre el centro de la abertura entre el controlador y expansión la cámara, es imprescindible que las hojas estén centradas y cubren toda la apertura de³⁹^,⁴¹. Tamaño de las hojas sobre la abertura resultará en fugas de aire de la cámara del conductor, una gota en la presión de explosión-potencial de membrana y la negación de la administración de la lesión por explosión. Situar correctamente y ajuste firmemente el bloque de acero accesorio contra la bomba de mano hidráulica cámara de bloque y el conductor también es esencial, ya que es apretando la perilla de la bomba de mano hidráulica y confirmando la cámara controlador permanece a presión sin fugas. La colocación correcta del bloque de acero permite la cámara controlador cierre firmemente contra la cámara de expansión, creando el sello obligatorio requerido por la cámara de apertura de las hojas de la membrana de Mylar y entre el compartimiento del conductor y expansión.

Durante la preparación antes de la extracción del recipiente MCA, gasear PSS con la necesaria mezcla de 21% O₂ y 5% CO₂ en un equilibrio de N₂ equilibra la solución y facilita el pH fisiológico neutro necesario preciso una trabajo PSS solución²¹^,³³^,³⁴.

Equilibrando los segmentos a una presión constante de 60 min²¹^,³²^,³³^,³⁴ es extremadamente obligatorio como este paso permite que los segmentos de constricción siguientes que muestra una dilatación máxima durante la su primera primaria presurización. Este evento demuestra la ocurrencia de tono espontáneo, una propiedad de una arteria sana³²^,³³^,³⁴. Aunque los niveles de presión clasificados para conseguir el equilibrio de segmentos se han utilizado en otros estudios³³^,³⁴^,⁴², este estudio y los de Mathew et al²¹, Golding et al³⁵ y Golding et al.⁴³ había equilibrado los segmentos a 50 mmHg. Mientras que equilibra segmentos entre 40 mmHg y 100 mmHg³² permite cierta flexibilidad y modificación para eso paso del Protocolo, un período de equilibrio de horas dentro de los parámetros de presión en última instancia confirma saludable arterias necesarias para la continuación del experimento.

Extremando la precaución al quitar el cerebro del cráneo y los segmentos MCA de izquierda y derecho del círculo de Willis manteniendo los vasos intactos es quizás el paso más crítico de todo protocolo. Pinchar el cerebro con las gubias hueso, desgarro o estiramiento severo de los segmentos durante la extracción o accidentalmente tirando los vasos con la espátula quirúrgica al excavar el cerebro fuera del cráneo, en definitiva, resultará en la destrucción de la cosecha MCA, causando los segmentos inservibles y continuado uso de ese conjunto de arterias, en última instancia, anular todo el experimento para ese animal.

Aunque medir respuestas vasculares cerebrales a los estímulos dilatorios o constrictory en MCA segmentos ex vivo recogido después de impacto o ráfaga TBI en vivo ha dado éxito, la metodología no es sin sus dificultades o limitaciones. Tal vez una de las complejidades más discernibles vinculadas con examinar las consecuencias del TCE sobre la circulación de la vasculatura cerebral es separar los efectos explícitos de TBI en los vasos de los efectos implícitos incurridos debido a los diversos materiales y elementos generados por el cerebro lesionado⁴⁴. Esta perplejidad concebible puede ser evadido potencialmente analizando ex vivo las reacciones vasoconstrictory y vasodilatadores de cosecha, perfusión o presurizado de MCA. En un esfuerzo por reducir la duración de tiempo que las arterias cerebrales en vivo están expuestas a descargado localmente parenquimal vasoactivo material antes de la muerte, la colección de las arterias cerebrales directamente después de TBI puede disminuir el grado de dicha exposición prolongada efectos. Ex vivo estudios aislados MCA presentan además la posibilidad de analizar los mecanismos de lesión vascular traumática a través del uso particular receptores agonistas y antagonistas o reputados vehículos de lesión vascular que no sería pagar un examen como eficientemente o como discriminatorias en vivo. Posteriormente, este ex vivo método puede combinarse con ex vivo de exposición a las drogas para probar respuestas miógenas resultantes (vasoconstricción o dilatación del segmento vascular debido a la exposición de drogas intravascular o extravascular).

Otras limitaciones incluyen aproximadamente o con impaciencia eliminación de MCA del cerebro cosechada puede resultar en la prematura rotura de los vasos, anulando así su uso. Además, dejando más de unos minutos transcurren la eutanasia del animal, colección de los vasos y su colocación en la solución preparada de PSS puede también negar su viabilidad. Correctamente realizadas y seguida, los métodos descritos en el presente Protocolo para las pruebas de respuestas miógenas de MCA después bTBI tarda varias horas de principio a fin y los intentos de limitar la longitud de tiempo requerido para el éxito pueden resultar en experimental falta. Sin embargo, este método se hace in vitro y utiliza considerablemente más rentable instrumentación y equipos de en vivo de alta resolución resonancia magnética (de Sr.) de⁴⁵^,⁴⁶ o la sonografía de Doppler convencional / técnicas velocimétricas⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹ que también se emplean para los estudios de la nave.

Estos resultados que bTBI leve lesión se asocia con deterioro cerebrales respuestas dilatorias a presión intravascular reducida podrían ser una función del vasospasm⁶^,⁷ y Coevolución hyperconstriction⁵⁰ divulgado previamente después de exposición de la ráfaga en última instancia conduciendo a las ocurrencias tales como reducción relativa de la perfusión cerebral. Además, daño provocado por la explosión impiden reacciones normales dilatorias de la vasculatura cerebral podría posiblemente promover una mayor reducción en la perfusión cerebral cuando se combina con la hipotensión arterial, una incidencia frecuente durante operaciones de combate.

Estos resultados indican que bTBI provoca un cambio en los mecanismos que facilita el control vascular arterial. Aunque se observaron deterioro vascular cerebral de la fase aguda de arterial respuesta miógena a reducciones en la presión intravascular para después de la lesión de al menos una hora, quedan vacíos en la fase aguda después de bTBI información. La importancia de identificar qué lesiones deficiencias físicas y bioquímicas de la vasculatura cerebral y la exposición del cerebro a bTBI causas pueden ayudar a determinar el nivel de éxito terapéutico y rehabilitación justo inmediatamente después de la lesión.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los estudios fueron terminados como parte de un equipo apoyado por el proyecto de Moody ‘ s de investigación traslacional de lesión de cerebro traumática y Premio W81XWH-08-2-0132 de la investigación médica del ejército de Estados Unidos y comando de Material – Ministerio de defensa.

Materials

Advanced Blast Simulator (ABS)	Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc.	N/A	Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries
Adult, male, Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	N/A	Experimental animals
Arteriograph	Living Systems Instrumentation, Inc.	Arteriograph	Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter
Bone rongeurs, large	FST Fine Science Tools	Friedman Rongeur	Brain extraction from skull
Bone rongeurs, small	FST Fine Science Tools	Boynton Rongeur	Brain extraction from skull
CaCl₂	Sigma	Calcium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Ear plugs	3M	Foam Ear Plugs 1100 Class AL	Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine
Glucose	Sigma	D-[+]-Glucose	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	Isoflurane, USP	Anesthetic
KCl	Sigma	Potassium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
MgSO₄•7H₂O	Sigma	Magnesium sulfate	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Microforceps	Buxton Biomedical Inc.	Micro Tying Fcps, 180mm	Brain extraction from skull
Mylar sheets	Texas Art Supply	Mylar	Membrane used for compressed air build-up during blasting
NaCl	Sigma	Sodium chloride	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
NaHCO₃	Sigma	Sodium bicarbonate	Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Nylon suture	Ethicon	10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm)	Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter
Scalpel blade #10	Bard-Parker	10 Stainless Steel Surgical Blade	Brain extraction from skull
Surgical spatula	Delmaks Surgico	Cement Spatula	Brain extraction from skull
Thermometer	Physitemp Instruments, Inc.,	Thermalert Monitoring Thermometer	Monitoring of experimental animal's core body temperature
Volume ventilator	Harvard Apparatus, Inc.	Small Animal Ventilator	Constant and steading breathing of the intubated experimental animal
Water blanket	Gaymar Industries, Inc.	Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad	Maintenance of experimental animal's body temperature

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Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, M. A., Hawkins, B. E., Prough, D. S., DeWitt, D. S. Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries. J. Vis. Exp. (146), e58792, doi:10.3791/58792 (2019).