Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Methoden für ex-Vivo vaskuläre Reaktivität Bestimmung nach einer primären Explosion traumatische Hirnverletzungen (bTBI) mit isoliert, unter Druck, Nagetier mittleren zerebralen arteriellen (MCA) Segmenten zu beschreiben. bTBI Induktion erfolgt mit einem Schock-Rohr, auch bekannt als eine erweiterte Explosion Simulator (ABS) Gerät.
Obwohl auf die histopathologischen und behavioralen Auswirkungen einer Explosion es Studien gab, haben weniger Explosion die zerebrale vaskuläre Effekte gewidmet. Auswirkungen (z. B., nicht-Blast) traumatische Hirnverletzungen (TBI) ist bekanntermaßen Druck Selbstregelung in der zerebralen Vasculature bei Menschen und Versuchstieren zu verringern. Die Hypothese, dass die Explosion verursachten traumatische Hirnverletzungen (bTBI), wie TBI, Einfluss beeinträchtigt zerebrale vaskuläre Reaktivität führt wurde durch Messung myogen dilatorisch Antworten zu vermindertem intravaskulären Druck in Nagetier mittleren zerebralen arteriellen (MCA) getestet Segmente von Ratten milde bTBI verwenden eine erweiterte Explosion Simulator (ABS) Schock Röhre ausgesetzt. Erwachsenen, männlichen Sprague-Dawley Ratten wurden betäubt, intubiert, belüftet und Sham bTBI (identische Manipulation und Anästhesie mit Ausnahme von Blast Verletzungen) oder milde bTBI vorbereitet. Ratten wurden randomisiert, Sham bTBI oder milde bTBI gefolgt von Opfer 30 oder 60 min nach der Verletzung zu erhalten. Unmittelbar nach bTBI aufrichtenden reflex (RR) Unterdrückung mal bewertet wurden, Euthanasie in der Zeit Punkte nach der Verletzung wurde fertiggestellt, das Gehirn wurde geerntet und MCA-Segmente wurden gesammelt, montiert und unter Druck gesetzt. Da die Intraluminal Druck durch die arterielle Segmente durchblutet in Schritten von 20 MmHg von 100 auf 20 MmHg reduziert wurde, waren MCA Durchmesser gemessen und aufgezeichnet. Mit abnehmender Intraluminal Druck, MCA Durchmesser stetig deutlich über dem Ausgangswert in den Schein bTBI Gruppen während MCA Dilatator Antworten deutlich reduziert wurden (p < 0,05) in beiden bTBI Gruppen wie belegt die Sehstörungen, kleinere MCA-Durchmesser für bTBI Gruppen aufgenommen. Darüber hinaus war RR Unterdrückung in den bTBI Gruppen signifikant (p < 0,05) höher als in den Schein bTBI Gruppen. MCA ist gesammelt von Sham bTBI Druck Gruppen ausgestellte typische gefäßerweiternde Eigenschaften zu einer Abnahme in Intraluminal Druck während MCAs nach bTBI deutlich ausgestellt gesammelt myogen gefäßerweiternde Antworten beeinträchtigt reduziert, die blieb für mindestens 60 min. nach bTBI.
Ähnlich, der sich aus den Auswirkungen (z. B., nicht-Blast) TBI, Blast-induzierte traumatische Hirnverletzungen (bTBI) hat zerebrale Gefäßverletzung1 zugeordnet und beeinträchtigt wie zerebrale vaskuläre kompensatorische Reaktionen auf Ereignisse Veränderungen in der Partialdruck von Kohlendioxid (PaCO2)2,3,4 und Sauerstoff (PaO2)5. Darüber hinaus hat Blast Exposition in Tiere6 und bTBI Patienten7,8zerebralen arteriellen Vasospasmen verursacht. Während klinische TBI9 und Flüssigkeit-Percussion Verletzungen (FPI)10,11,12 des arteriellen Blutdrucks beeinträchtigt zerebrale vaskuläre Reaktionen auf Änderungen zugeordnet sind (z. B., Druck Selbstregelung)9,10,11,12, Unsicherheiten bezüglich der Auswirkungen von bTBI auf zerebrale vaskuläre Druckleistung Selbstregelung.
Der zerebrale Durchblutung reagiert auf Schwankungen im systemischen arteriellen Druck mit der Absicht der Aufrechterhaltung einer kontinuierlichen Sauerstoff und Nährstoffversorgung an die metabolisch aktiven Gehirn13,14,15geliefert, 16. Eine einzigartige Art der Homöostase, Selbstregelung17,18,19 tritt auf, wenn “ein Organ einen ständigen Blutfluss trotz Änderungen im Blutdruck (Perfusion) oder andere physiologische oder pathologische Reize unterhält” 20. zerebrale Arterien verengen oder erweitern in Reaktion auf Veränderungen des Blutdrucks, Stickstoffmonoxid (NO), Viskosität des Blutes, PaCO2 und PaO2, usw.4,11,16, 21. arterielle myogen Antwort bezieht sich auf solche Kontraktionen oder Streckungen. Die myogen vaskuläre Antwort, erstmals beschrieben von Bayliss22 und einen wichtigen Mechanismus zur Selbstregelung der CBF, zeichnet sich durch Vasokonstriktion steigt Perfusionsdruck und Gefäßerweiterung Perfusionsdruck sinkt 14 , 17. diese vaskuläre Reaktion ist die angeborene Fähigkeit der kontraktilen Gewebe (z. B. vaskulären glatten Muskelzellen, VSMC der) zu reagieren, zu dehnen und/oder Änderungen im Lumen und/oder Wand Spannung23,24, 25,26,27,28,29. Wenn Arterien gestreckt sind (z. B., während des intravaskulären Druck erhöht), VSMCs verengen24,25,26,28.
Studien, die Widerstand Schiffe prüfen ex Vivo haben häufig eine der beiden Methoden für die Prüfung der pharmakologischen und physiologische Eigenschaften der isolierten Widerstand Schiffe eingesetzt: der Ring montiert-Methode und der kanülierte unter Druck Methode. Der Ring montiert Schiff Vorbereitung Methode besteht darin, zwei Drähte, die Intraluminally durch das Schiff Segment übergeben die Segment in Position zu halten. Messung der Menge der Krafteinwirkung auf den isometrisch nachhaltigen Drähten misst die Stimulation der VSMC. Aber diese Technik birgt gewisse Vorbehalte, vor allem den unvermeidlichen erlittenen Schäden durch die endotheliale Schicht des lumens als die Drähte durchlaufen sind30 und das unterschiedliche Ausmaß der Dehnung, getragen von der isolierten Gruppe Das wiederum führt zu Schiff Wand Distension, letztlich Auswirkungen auf das Schiff Sensibilität für pharmakologische Wirkstoffe31. Kanülierte, unter Druck stehende Behälter Vorbereitung Methode nutzt eine Arteriograph bestehend aus zwei getrennten Kammern, die jedes Haus die Platzierung von einem mittleren zerebralen arteriellen (MCA) von einem einzigen Tier geerntet. Eine Mikropipette wird in jedem Ende des Segments eingefügt, das proximale Ende des Segments der Mikropipette mit Nähten befestigt wird und das Lumen ist sanft mit einer physiologischen Salzlösung (PSS) durchströmt, um Blut und andere Substanzen zu beseitigen. Das distale Ende wird mit Nähten befestigt. Transmural oder luminalen Druck gesetzt durch die Erhöhung der beiden Stauseen befestigt jede Pipette in eine passende Höhe oberhalb jedes Segment aber in unterschiedlichen Höhen in Bezug auf die anderen32,33,34,35 ,36. Druckaufnehmer entlang der Stauseen und Mikropipetten bieten Perfusion Druckmessungen, während Schiffe sind mit einem inversen Mikroskop mit Monitor, Video-Kamera und ermöglicht für die Messung der externen Scaler ausgestattet vergrößert MCA-Durchmessern. Obwohl beide Methoden wertvolle sind, kanülierte, unter Druck stehende Behälter Vorbereitung Methodik besser imitiert und Genehmigungen die Gefäße untersucht, um näher an ihre in Vivo Bedingungen32,37.
Die Auswirkungen der verschiedenen Arten von Auswirkungen (z. B., nicht-Blast) TBI auf zerebrale vaskuläre Antworten zuvor im zerebralen arteriellen Segmente21,35,36,38untersucht worden. Mit einer ähnlichen ex Vivo-MCA-Protokoll für Schiff Sammlung, Montage und Perfusion wie in der aktuellen Studie beschrieben, erzielt frühere Studien Erfolg mit ihren jeweiligen Untersuchungen in der damit verbundenen Mechanismen der zerebralen Vasculature Dysfunktion folgenden TBI. Golding Et Al.34 untersucht endothelial vermittelte Streckungen im Erwachsenen, männlichen Long-Evans Ratte MCA folgt strengen TBI durch kontrollierte kortikalen Auswirkungen (CCI) Verletzungen. In einer zweiten Studie, Golding Et Al.36 untersucht cerebrovaskuläre Reaktivität, Hypotonie oder CO2 nach der Ernte der MCA von Ratten, die eine milde CCI erlitten. Yu Et Al.38 analysiert, ob Peroxynitrit Radikalfänger verbesserte zögerliche Antworten auf intravaskulären Druck im Erwachsenen, männlichen Sprague-Dawley Ratten MCA Segmente FPI ausgesetzt reduziert, während Mathew Et Al.21 myogen Antworten zu untersucht Hypotonie in MCA ist nach moderat, geerntet zentrale FPI.
Um besser die Hypothese untersucht, dass bTBI, wie nicht-Blast TBI, führt zu eingeschränkter zerebrale vaskuläre Reaktivität, testeten wir einen Mechanismus zur kompromittierten Selbstregelung durch Messung myogen zögerliche Antworten zu vermindertem intravaskulären Druck Ex-Vivo in isolierten, unter Druck stehende Nagetier MCA Segmenten (Abbildung 1) von Ratten ausgesetzt, milde bTBI anhand eines erweiterten Blast Simulator (ABS) Schock Röhre (Abbildung 2 und Abbildung 3) gesammelt (siehe Rodriguez Et Al.39 Tabelle 1) verwendet Druckluft direkt an einer Fahrer-Kammer, Freidlander-artigen40 über und unter Hochdruck zu erzeugen Wellen geliefert (siehe Rodriguez Et Al.39Abb. 1A).
Abbildung 1 : Lage des mittleren zerebralen Arterien (MCA). Ventrale Ansicht der Rattengehirn markieren die Lage der MCA relativ zum hinteren Hirnarterien (PCA), interne Halsschlagadern (ICA), externe Halsschlagadern (ECA), a. basilaris (BA) und gemeinsame Halsschlagadern (CCA). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Erweiterte Explosion Simulator (ABS) Rohr Stoßsicherung. Das ABS verwendet, um primäre Blast Verletzungen bei allen Tieren der Studie zu produzieren. 1 = Fahrer Kammer; 2 = Expansionskammer; 3 = Probenkammer; 4 = reflektierte Welle Suppressor; gelber Stern = Probentablett. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Wie bei allen Protokollen und Anweisungen, ist es zwingend erforderlich, dass bestimmte Schritte für das Protokoll in dieser bestimmten Studie möglichst genau eingehalten werden und so genau wie möglich. Nach der anfänglichen Intubation der Ratte ist es zu bestätigen, dass es stetig und ohne Schwierigkeit Atmung ist wichtig. Irrtümlich Einfügen der endotrachealen Schlauch in die Speiseröhre anstelle der Luftröhre führt zu raspeln, schwere Atmen, Blutungen und die anschließende mitreißend der Ratte durch mangelhafte Narkose Lieferung zu den Lungen.
Wenn die Mylar-Membran-Blätter über der Mitte der Öffnung zwischen dem Fahrer und den Ausbau Kammer taping, ist es unerlässlich, dass die Blätter zentriert sind und decken die gesamte Öffnung39,41. Szenario der Blätter über der Öffnung führt Luftverlust von der Fahrer-Kammer, ein Tropfen auf den erforderlichen Druck Membran Burst-Potenzial und Denial-of-Verwaltung der Explosion Verletzung. Richtig Situierung und sicher Montage Zubehör Stahlblock gegen Hand-Hydraulikpumpe Block und Fahrer Kammer ist auch wichtig, da die hydraulische Hand-Pumpe-Knopf anziehen ist und bestätigt der Fahrer Kammer bleibt unter Druck ohne Lecks. Die richtige Platzierung des Stahlblocks ermöglicht der Treiber Kammer fest gegen die Expansionskammer, wodurch die obligatorische Dichtung erforderlich, über die Öffnung durch die Mylar-Membran-Blätter und zwischen Fahrer und Ausbau Kammer Kammer zu schließen.
Während der Vorbereitungen vor der MCA-Schiff-Extraktionen, Begasung der PSS mit der nötigen Mischung aus 21 % O2 und 5 % CO2 in ein ausgewogenes Verhältnis von N2 gestalten die Lösung und erleichtert die machte pH-neutralen physiologischen Bedarf für eine PSS Lösung21,33,34arbeiten.
Äquilibrierung der Segmente bei konstantem Druck für 60 min.21,32,33,34 ist extrem obligatorisch, da dieser Schritt die Segmente ermöglicht um Folgendes zu verengen, was, denen eine maximale Ausdehnung während angezeigt Ihre ersten primären Druckbeaufschlagung. Dieses Ereignis zeigt das Auftreten von spontanen Ton, eine Eigenschaft, die für eine gesunde Arterie32,33,34. Obwohl verschiedene Druckstufen für Segment Gleichgewichtherstellung sein, in anderen Studien33,34,42, diese Studie und die von Mathew verwendet worden Et Al.21, Golding Et Al.35 und Golding Et Al.43 equilibriert die Segmente auf 50 MmHg. Während Äquilibrierung gesammelt Segmente irgendwo zwischen 40 MmHg – 100 MmHg32 ermöglicht Flexibilität und Modifikation für diesen Schritt des Protokolls, ein Zeitraum von Stunden Gleichgewichtherstellung innerhalb dieser Parameter Druck letztendlich gesunde bestätigt Arterien, die für die Fortsetzung des Experiments benötigt.
Bedacht zu nehmen, wenn das Gehirn aus dem Schädel und der linken und rechten MCA Segmente aus dem Kreis von Willis zu entfernen, während die Schiffe intakt zu halten, ist vielleicht der wichtigste Schritt das gesamte Protokoll. Punktion des Gehirns mit den Knochen Rongeurs, führt reißen oder schwere Dehnung der Segmente bei der Entnahme oder versehentlich ziehen die Schiffe mit dem chirurgischen Spatel, wenn das Gehirn aus dem Schädel Aushub letztlich Zerstörung der geernteten MCA, verursacht unbrauchbarer Segmente und eingestellt Verwendung dieser Reihe von Arterien, letztlich das gesamte Experiment für das Tier zu stornieren.
Wenn zerebrale vaskuläre Reaktionen auf aufschiebende oder constrictory Reize im MCA Segmente ex Vivo Messung nach dem Aufprall gesammelt oder Explosion TBI in-vivo hat Erfolg gebracht, ist die Methode nicht ohne seine Schwierigkeiten und/oder Einschränkungen. Vielleicht ist eines der mehr erkennbaren Komplexität im Zusammenhang mit der Untersuchung der Folgen der TBI auf die Zirkulation des zerebralen Gefäßsystems trennen die explizite Auswirkungen der TBI auf den Schiffen aus der impliziten Effekte entstehen durch die verschiedenen Materialien und Elemente durch das geschädigte Gehirn44erzeugt. Diese denkbar Ratlosigkeit kann möglicherweise umgangen werden, durch die Analyse ex Vivo die vasoconstrictory und gefäßerweiternde Reaktionen der geerntet, durchblutet und/oder MCA mit Druck beaufschlagt. In dem Bemühen, die Dauer der Zeit reduzieren, die Hirnarterien in-vivo vor Ort entladen parenchymatösen vasoaktive Material vor dem Tod ausgesetzt sind, kann Sammlung der Hirnarterien direkt nach TBI die so verlängert-Belastung vermindern Effekte. Ex-Vivo-Studien an isolierten MCA zusätzlich präsentieren Sie die Aussicht auf eine Analyse der Mechanismen der traumatischen Gefäßverletzung durch den Einsatz von bestimmten Rezeptor-Agonisten und Antagonisten oder angeblichen Fahrzeuge der Gefäßverletzung, die Prüfung als nicht leisten würde effizient oder als diskriminierend in Vivo. Anschließend kann diese ex-Vivo-Methode mit ex-Vivo Exposition gegenüber Drogen, daraus resultierende myogen Antworten (Vasokonstriktion oder Dilatation der Schiff-Segment durch intravaskulären oder extravascular Arzneimittelexposition) testen kombiniert werden.
Andere Einschränkungen umfassen etwa oder ungeduldig entfernen der MCA aus dem geernteten Gehirn die vorzeitige reißen der Gefäße, so stornieren ihre Verwendung führen kann. Darüber hinaus kann mehr als ein paar Minuten zwischen Euthanasie des Tieres verstreichen zu lassen, Sammlung der Schiffe und ihrer Platzierung in der vorbereiteten PSS-Lösung auch ihre Lebensfähigkeit zunichte machen. Wenn richtig durchgeführt und folgte, können die Methoden beschrieben, die in diesem Protokoll zu Testzwecken myogen Antworten der MCA nach bTBI mehrere Stunden von Anfang dauert bis Ende und Versuche einer Einschränkung der Länge der Zeitaufwand für den Erfolg im experimentellen führen. Fehler. Allerdings ist diese Methode getan in-vitro- und nutzt deutlich mehr kostengünstige Instrumentierung und Ausrüstung als in-vivo hochauflösende Magnetresonanztomographie (MR) Bildgebung45,46 oder konventionellen Doppler-Sonographie / velocimetric Techniken47,48,49 die auch für Schiff Studien eingesetzt werden.
Diese Ergebnisse, dass milde bTBI Verletzung beeinträchtigt zerebralen dilatorisch Antworten zu vermindertem intravaskulären Druck zugeordnet ist könnte möglicherweise eine Funktion des Vasospasmus6,7 und VSMC Hyperconstriction50 zuvor berichtete nach Explosion letztlich zu Ereignissen wie z. B. relative zerebrale Durchblutung reduziert. Darüber hinaus könnte Blast-induzierten Schäden behindern normale dilatorisch Reaktionen des zerebralen Gefäßsystems möglicherweise weiter Rückgang der zerebralen Perfusion in Kombination mit arterielle Hypotonie, eine häufige Inzidenz während der Kampfhandlungen fördern.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser bTBI ergibt sich eine Änderung auf die Mechanismen erleichtert die arteriellen Gefäßerkrankungen Kontrolle. Obwohl akute-Phase zerebrale vaskuläre Beeinträchtigung der arteriellen myogen Antwort zu einem Rückgang der intravaskulären Druck für mindestens eine Stunde nach der Verletzung beobachtet wurden, noch gibt es Lücken in den Informationen im Zusammenhang mit der akuten Phase nach bTBI. Die Bedeutung der Identifizierung, welche körperlichen und biochemischen Mängel Verletzungen der zerebralen Vasculature und der Gehirn-Exposition gegenüber bTBI, die Ursachen helfen konnte, bei der Festlegung der therapeutische bzw. rehabilitative Erfolg ziemlich sofort nach der Verletzung.
The authors have nothing to disclose.
Studien wurden als Teil eines Teams, unterstützt durch das Moody-Projekt für Translationale traumatische Verletzungen Hirnforschung und W81XWH-08-2-0132 Award von der U.S. Army Medical Research und Material-Befehl – Department of Defense abgeschlossen.
Advanced Blast Simulator (ABS) | Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. | N/A | Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries |
Adult, male, Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | N/A | Experimental animals |
Arteriograph | Living Systems Instrumentation, Inc. | Arteriograph | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Bone rongeurs, large | FST Fine Science Tools | Friedman Rongeur | Brain extraction from skull |
Bone rongeurs, small | FST Fine Science Tools | Boynton Rongeur | Brain extraction from skull |
CaCl2 | Sigma | Calcium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Ear plugs | 3M | Foam Ear Plugs 1100 Class AL | Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine |
Glucose | Sigma | D-[+]-Glucose | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | Isoflurane, USP | Anesthetic |
KCl | Sigma | Potassium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
MgSO4•7H2O | Sigma | Magnesium sulfate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Microforceps | Buxton Biomedical Inc. | Micro Tying Fcps, 180mm | Brain extraction from skull |
Mylar sheets | Texas Art Supply | Mylar | Membrane used for compressed air build-up during blasting |
NaCl | Sigma | Sodium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
NaHCO3 | Sigma | Sodium bicarbonate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Nylon suture | Ethicon | 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Scalpel blade #10 | Bard-Parker | 10 Stainless Steel Surgical Blade | Brain extraction from skull |
Surgical spatula | Delmaks Surgico | Cement Spatula | Brain extraction from skull |
Thermometer | Physitemp Instruments, Inc., | Thermalert Monitoring Thermometer | Monitoring of experimental animal's core body temperature |
Volume ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | Small Animal Ventilator | Constant and steading breathing of the intubated experimental animal |
Water blanket | Gaymar Industries, Inc. | Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad | Maintenance of experimental animal's body temperature |