Vi præsenterer her, en protokol for at beskrive metoder for ex vivo vaskulære reaktivitet bestemmelse efter en primær blast traumatisk hjerneskade (bTBI) ved hjælp af isolerede, trykisoleret, gnaver midterste cerebral arteriel (MCA) segmenter. bTBI induktion er udført ved hjælp af et stød rør, også kendt som en avanceret Blast Simulator (ABS) enhed.
Selvom der har været undersøgelser på de histopatologiske og adfærdsmæssige konsekvenser af blast eksponering, har færre været dedikeret til blast’s cerebrale vaskulære effekter. Effekt (dvs., ikke-blast) traumatisk hjerneskade (TBI) er kendt for at nedsætte trykket autoregulation i cerebral Vaskulaturen i både mennesker og forsøgsdyr. Den hypotese, at blast-induceret traumatisk hjerneskade (bTBI), som påvirker TBI, resulterer i nedsat cerebrale vaskulære reaktivitet blev testet ved at måle myogenic forhalende svar til reduceret intravaskulær tryk i gnavere midterste cerebral arteriel (MCA) segmenter fra rotter udsat for mild bTBI ved hjælp af en avanceret Blast Simulator (ABS) stød rør. Voksen, mandlige Sprague-Dawley rotter var anesthetized, intuberet, ventileret og forberedt til Sham bTBI (identisk manipulation og anæstesi med undtagelse af blast skade) eller mild bTBI. Rotter blev randomiseret til at modtage Sham bTBI eller mild bTBI efterfulgt af offer 30 eller 60 min. efter skade. Umiddelbart efter bTBI, oprettende refleks (RR) undertrykkelse gange blev vurderet, eutanasi på tid point efter skaden var afsluttet, hjernen blev høstet og de enkelte MCA segmenter var indsamlet, monteret og tryk. Som intraluminal presset perfunderet via de arterielle segmenter blev reduceret i 20 mmHg intervaller fra 100 til 20 mmHg, blev MCA diametre måles og registreres. Med faldende intraluminal pres, MCA diametre støt steget betydeligt over baseline i Sham bTBI grupper, mens MCA dilator svar blev reduceret betydeligt (p < 0,05) i begge bTBI grupper som det fremgår af de synshæmmede, mindre MCA diametre registreres for bTBI grupperne. Derudover RR undertrykkelse i bTBI-grupperne var væsentligt (p < 0,05) højere end i Sham bTBI grupper. MCA er indsamlet fra Sham bTBI grupper udstillede typiske vasodepressivt egenskaber at falder i intraluminal pres mens MCAS indsamlet efter bTBI udstillet betydeligt forringet myogenic vasodepressivt svar til reduceret tryk, varet i mindst 60 min efter bTBI.
Ligner der følger af effekt (dvs., ikke-blast) TBI, blast-induceret traumatisk hjerneskade (bTBI) har været forbundet med cerebrale vaskulære skade1 og forringet cerebrale vaskulære kompenserende svar til forekomster indkvartering ændringer i delvis pres af kuldioxid (PaCO2)2,3,4 og ilt (PaO2)5. Derudover har blast eksponering forårsaget cerebral arteriel vasospasme i dyr6 og bTBI patienter7,8. Mens kliniske TBI9 og væske-percussion skade (FPI)10,11,12 er forbundet med nedsat cerebral vascular responses til ændringer i arterielt blodtryk (dvs., pres autoregulation)9,10,11,12, fortsat usikkerhed med hensyn til virkningerne af bTBI på cerebral blodkartryk autoregulation kapacitet.
Den cerebrale cirkulation reagerer på variationer i systemisk arterietryk med hensigten at opretholde en kontinuerlig ilt og næringsstoffer levering leveret til metabolisk aktive hjernen13,14,15, 16. En unik type homøostase, autoregulation17,18,19 opstår, når “en orgel opretholder en konstant blodgennemstrømning trods ændringer i blodtryk (perfusion) eller andre fysiologiske eller patologiske stimuli” 20. cerebrale arterier snøre eller spile som reaktion på variationer i blodtryk, nitrogenoxid (NO), blod viskositet, PaCO2 og PaO2etc.4,11,16, 21. arteriel myogenic svar henviser til sådanne sammentrækninger eller dilations. Den myogenic vaskulære reaktion, første gang beskrevet af Bayliss22 og en større mekanisme bidrager til autoregulation af CBF, er karakteriseret ved vasokonstriktion hvis perfusion trykket stiger og vasodilatation, hvis perfusion trykket falder 14 , 17. denne vaskulære svar er kontraktive væv (såsom vaskulære glatte muskelceller, VSMC’S) iboende evne til at reagere på stræk og/eller ændringer i lumen og/eller væg spændinger23,24, 25,26,27,28,29. Når arterierne er strakt (f.eks., under intravaskulær pres stiger), VSMCS snøre24,25,26,28.
Undersøgelser, der undersøger modstand fartøjer ex vivo har almindeligvis ansat en af to metoder til test af farmakologiske, fysiologiske egenskaber af isolerede modstand fartøjer: metoden ring-monteret og den kanylerede, tryk metode. Ring-monteret fartøj forberedelse metode indebærer to ledninger bestået intraluminally gennem fartøj segment, som holder segmentet på plads. Måle mængden af kraft på isometrisk vedvarende ledningerne gauges stimulering af VSMC. Dog, denne teknik bærer med sig visse forbehold, især, den uundgåelige skader påført i endothelial lag af lumen, som ledningerne er passeret gennem det30 og den varierende grad af stretching påført den isoleret segment som igen fører til fartøj væg udspiling, der i sidste ende påvirker fartøjets følsomhed over for farmakologiske stoffer31. Kanylerede, trykisoleret fartøj forberedelse metode udnytter en arteriograph består af to separate kamre, der hver hus placeringen af en midterste cerebral arteriel (MCA) høstet fra en enkelt dyr. En mikropipette indsættes i hver ende af segmentet, den proksimale ende af segmentet er fastgjort til mikropipette med suturer og lumen er sagte perfunderet med en fysiologisk saltopløsning (PSS) for at fjerne blod og andre stoffer. Den distale ende er sikret med suturer. Transmural eller luminale pres indstilles ved at hæve de to reservoirer knyttet til hver pipette til en passende højde over hvert segment, men i forskellige højder med hensyn til de andre32,33,34,35 ,36. Tryktransducere placeret langs reservoirer og Mikropipetter giver perfusion pres målinger, mens skibe er forstørrede ved hjælp af en omvendt mikroskop udstyret med skærm, video kamera og scaler giver mulighed for måling af eksterne MCA diametre. Selvom begge metoder er værdifulde, kanylerede, trykisoleret fartøj forberedelse metode bedre efterligner og tilladelser til fartøjer undersøgt for at være tættere på deres i vivo betingelser32,37.
Effekterne af forskellige typer af virkninger (dvs., ikke-blast) TBI på cerebrale vaskulære svar er tidligere blevet undersøgt i cerebral arteriel segmenter21,35,36,38. Hjælp af en lignende ex vivo MCA protokol for fartøjet samling, montering og perfusion som beskrevet i den aktuelle undersøgelse, opnået tidligere undersøgelser succes med deres respektive undersøgelser i de tilhørende mekanismer af cerebral Vaskulaturen dysfunktion følgende TBI. Golding et al.34 undersøgt endotel-medieret dilations i voksen, mandlige Long-Evans rotte MCAS efter svær TBI gennem kontrolleret kortikale indvirkning (CCI) skade. I en anden undersøgelse, Golding et al.36 undersøgt cerebrovaskulær reaktivitet hypotension eller CO2 efter høst MCAS fra rotter, der har lidt en mild CCI. Yu et al.38 analyseres om peroxynitrite skyllevæsker forbedret forhalende svar til reduceret intravaskulær pres i voksen, mandlige Sprague-Dawley rotte MCA segmenter udsat for FPI mens Mathew et al.21 studerede myogenic svar til hypotension i MCA er høstet efter moderat, centrale FPI.
For at bedre undersøge hypotesen at bTBI, som ikke-blast TBI, resulterer i nedsat cerebrale vaskulære reaktivitet, vi testede en mekanisme bidrager til kompromitteret autoregulation ved at måle myogenic forhalende svar til reduceret intravaskulær tryk ex vivo i isolerede, trykisoleret gnaver MCA segmenter (figur 1) indsamlet fra rotter udsat for mild bTBI ved hjælp af en avanceret Blast Simulator (ABS) stød rør model (figur 2 og figur 3) (Se Rodriguez et al.39 Tabel 1) der bruger trykluft leveres direkte til en driver kammer til at generere Freidlander-lignende40 over og under low-pressure bølger (Se Rodriguez et al.39figur 1A).
Figur 1 : Placering af midt cerebrale arterier (MCA). Ventrale visning af rotte hjernen fremhæve placering af MCA i forhold til den posteriore cerebrale arterier (PCA), interne carotis arterierne (ICA), eksterne carotis arterierne (ECA), basilar arterie (BA) og fælles carotis arterier (CCA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Avanceret Blast Simulator (ABS) stød rør enhed. ABS anvendes til at fremstille primære blast skade i alle undersøgelse dyr. 1 = driver kammer; 2 = ekspansion kammer; 3 = modellen kammer; 4 = reflekteret bølge suppressor; gul stjerne = modellen bakke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Som med alle protokoller og instruktioner, er det bydende nødvendigt, at visse skridt for protokollen i denne særlige undersøgelse følges så præcist og så præcist som muligt. Efter den indledende intubation af rotte er det vigtigt at bekræfte, at det vejrtrækning støt og uden besvær. Fejlagtigt indlagde den endotrakealtube i spiserøret i stedet for luftrøret vil resultere i raspende, vanskelige vejrtrækninger, blødning og den efterfølgende rousing af rotte på grund af mangelfuld bedøvelsesmiddel levering til lungerne.
Når taping mylar membran plader over midten af åbningen mellem de driver og udvidelse kammer, er det bydende nødvendigt, at arkene er centreret og dækker hele åbning39,41. Misaligning arkene over åbningen vil resultere i luften lækage fra driver kammer, en dråbe i kræves trykket til membranen burst-potentiale og benægtelse af administration af blast skade. Korrekt placere og sikkert montering tilbehør stålblok mod den hydrauliske håndpumpe blok og driver kammer er også afgørende, som er ved at stramme hydraulisk hånd pumpe knop og bekræfter driver kammer forbliver trykisoleret uden utætheder. Korrekt placering af stålblok tillader driveren kammeret tæt lukke mod ekspansion kammer, således at der skabes den obligatoriske seal kræves over kammer åbning af Mylar membran ark og mellem den driver og udvidelse kammer.
Under forberedelserne før MCA fartøj ekstraktioner, gasning PSS med den nødvendige blanding af 21% O2 og 5% CO2 i en balance mellem N2 afbalancerer løsningen og letter necessitated neutral fysiologisk pH behov for en arbejder PSS løsning21,33,34.
Equilibrating segmenter på et konstant pres for 60 min.21,32,33,34 er yderst obligatorisk som dette trin tillader segmenter til at snøre følgende en maksimal dilatation vises under deres første primære opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet. Denne begivenhed viser forekomsten af spontan tone, en ejendom tyder på en sund arterie32,33,34. Selvom assorterede pres niveauer for segment ækvilibrering har været udnyttet i andre undersøgelser33,34,42, denne undersøgelse og de af Mathew et al.21, Golding et al.35 og Golding et al.43 ekvilibreres segmenter på 50 mmHg. Mens equilibrating indsamlet segmenter overalt mellem 40 mmHg – 100 mmHg32 , der giver mulighed for nogle fleksibilitet og ændring til trinnet i protokollen, en timer ækvilibrering periode inden for disse parametre, pres i sidste ende bekræfter sund arterier behov for fortsættelse af eksperimentet.
At tage ekstrem forsigtighed, når du fjerner hjernen fra kraniet og de venstre og højre MCA segmenter fra kredsen af Willis samtidig med disse fartøjer intakt er måske den mest afgørende skridt i den hele protokol. Punktering hjernen med knogle rongeurs, vil rive eller svær udspænding af segmenter under fjernelse eller ved et uheld trække fartøjer med den kirurgiske spatel når udgravning hjernen ud af kraniet i sidste ende resultere i ødelæggelse af de høstede MCA, forårsager ubrugelig segmenter og ophørte brugen af sæt af arterierne, i sidste ende tømme hele eksperimentet for dette dyr.
Om måling af cerebrale vaskulære svar til forhalende eller constrictory stimuli i MCA segmenter ex vivo indsamlet efter indflydelse eller blast TBI in vivo har givet succes, er metoden ikke uden sine vanskeligheder og/eller begrænsninger. Måske en af de mere mærkbare kompleksiteten forbundet med undersøge konsekvenserne af TBI på omsætning af cerebral Vaskulaturen afmontering udtrykkeligt virkningerne af TBI på fartøjer fra de implicitte virkninger som følge af de forskellige materialer og elementer genereret af skadede hjernen44. Denne tænkeligt rådvildhed kan potentielt blive omgået ved at analysere ex vivo vasoconstrictory og vasodepressivt reaktioner høstet, perfunderet og/eller tryk MCA’S. I et forsøg på at reducere varigheden af tid, cerebrale arterier in vivo er udsat for lokalt udledes parenkymalt vasoaktive materiale forud for døden, samling af den cerebrale arterier direkte efter TBI kan mindske graden af sådanne langvarig eksponering effekter. Ex vivo undersøgelser på isolerede MCA desuden præsentere udsigten til analysere mekanismerne for traumatisk vaskulære skade ved hjælp af særlige receptor agonister og antagonister eller ansete køretøjer af vaskulære skade, der ikke yder kontrol som effektivt eller som diskriminerende i vivo. Efterfølgende, kan dette ex vivo metode kombineres med ex vivo eksponering for stoffer til at teste resulterende myogenic svar (vasokonstriktion eller dilatation af fartøjet segment som følge af intravaskulær eller ekstravaskulære stof eksponering).
Andre begrænsninger omfatter groft eller utålmodigt at fjerne MCA fra høstede hjernen, hvilket kan resultere i for tidlig rivning af fartøjer, dermed tømme deres brug. Derudover kan at lade mere end et par minutter mellem eutanasi af dyret, samling af fartøjerne og deres placering i den forberedte PSS løsning også negere deres levedygtighed. Når korrekt udført og fulgt kan de metoder, der beskrives i denne protokol til test myogenic svar af MCAS efter bTBI tager det flere timer fra start til slut og forsøger på forkorte længden af tid, der kræves for succes resultere i eksperimentel fiasko. Men denne metode er gjort in vitro- og udnytter betydeligt mere omkostningseffektive instrumentering og udstyr end in vivo høj opløsning magnetisk resonans (MR) imaging45,46 eller konventionel Doppler Sonografi / velocimetric teknikker47,48,49 som er også ansat til fartøj undersøgelser.
Disse resultater, mild bTBI skade er forbundet med nedsat cerebral forhalende svar til reduceret intravaskulær tryk kunne potentielt være en funktion af vasospasme6,7 og VSMC hyperconstriction50 tidligere rapporteret efter blast eksponering i sidste ende fører til begivenheder såsom reduceret relative cerebral perfusion. Derudover kunne blast-induceret skade hæmmer normal forhalende reaktioner af cerebral Vaskulaturen eventuelt fremme yderligere reduktioner i cerebral perfusion når kombineret med arteriel hypotension, en hyppig forekomst under kampoperationer.
Disse resultater viser, at bTBI resulterer i en ændring til de mekanismer, der letter arteriel vaskulære kontrol. Selv om akut-fase cerebrale vaskulære værdiforringelse af arteriel myogenic svar til reduktioner i intravaskulær pres for mindst en time efter skade blev bemærkede, stadig der mangler i oplysninger, der omgiver den akutte fase efter bTBI. Betydningen af at identificere hvilke fysiske og biokemiske mangler skader på de cerebrale kar og hjerne eksponering for bTBI årsager kunne støtte ved fastsættelsen af terapeutiske og/eller rehabiliterende succes forholdsvis umiddelbart efter skaden.
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelser blev udført som en del af et team, der støttes af The Moody projekt for Translationel traumatisk hjerne skade forskning og award W81XWH-08-2-0132 fra den amerikanske hær medicinalforskning og materiale kommando – Department of Defense.
Advanced Blast Simulator (ABS) | Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. | N/A | Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries |
Adult, male, Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | N/A | Experimental animals |
Arteriograph | Living Systems Instrumentation, Inc. | Arteriograph | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Bone rongeurs, large | FST Fine Science Tools | Friedman Rongeur | Brain extraction from skull |
Bone rongeurs, small | FST Fine Science Tools | Boynton Rongeur | Brain extraction from skull |
CaCl2 | Sigma | Calcium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Ear plugs | 3M | Foam Ear Plugs 1100 Class AL | Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine |
Glucose | Sigma | D-[+]-Glucose | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | Isoflurane, USP | Anesthetic |
KCl | Sigma | Potassium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
MgSO4•7H2O | Sigma | Magnesium sulfate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Microforceps | Buxton Biomedical Inc. | Micro Tying Fcps, 180mm | Brain extraction from skull |
Mylar sheets | Texas Art Supply | Mylar | Membrane used for compressed air build-up during blasting |
NaCl | Sigma | Sodium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
NaHCO3 | Sigma | Sodium bicarbonate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Nylon suture | Ethicon | 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Scalpel blade #10 | Bard-Parker | 10 Stainless Steel Surgical Blade | Brain extraction from skull |
Surgical spatula | Delmaks Surgico | Cement Spatula | Brain extraction from skull |
Thermometer | Physitemp Instruments, Inc., | Thermalert Monitoring Thermometer | Monitoring of experimental animal's core body temperature |
Volume ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | Small Animal Ventilator | Constant and steading breathing of the intubated experimental animal |
Water blanket | Gaymar Industries, Inc. | Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad | Maintenance of experimental animal's body temperature |