Her presenterer vi en protokoll for å beskrive metoder for ex vivo vaskulær reaktivitet besluttsomhet etter en primær blast traumatisk hjerneskade (bTBI) bruker isolert, trykksatt, gnager midten cerebral arteriell (MCA) segmenter. bTBI induksjon gjøres ved hjelp av et sjokk rør, også kjent som en avansert Blast Simulator (ABS) enhet.
Selv om det har vært studier på histopathological og atferdsmessige effekter av eksplosjon eksponering, dedikert færre til blast’s cerebral vaskulær effekter. Betydning (dvs., ikke-blast) traumatisk hjerneskade (TBI) er kjent for å redusere trykket autoregulation i hjerne blodkar i både mennesker og forsøksdyr. Hypotesen som eksplosjon-indusert traumatisk hjerneskade (bTBI), som påvirker TBI, fører til svekket cerebral vaskulær reaktivitet ble testet ved å måle myogenic dilatory reaksjoner til redusert intravascular trykk i gnager midten cerebral arteriell (MCA) segmenter fra rotter utsatt for mild bTBI bruker en avansert Blast Simulator (ABS) sjokk rør. Voksen, mannlige Sprague-Dawley rotter var anesthetized, intubated, ventilert og forberedte humbug bTBI (identiske manipulasjon og anestesi unntatt blast skade) eller mild bTBI. Rotter ble randomisert til å motta humbug bTBI eller mild bTBI etterfulgt av offer 30 eller 60 minutter etter skade. Umiddelbart etter bTBI, rettende refleks (RR) undertrykkelse ganger ble vurdert, euthanasia på tide poeng etter skade ble fullført, hjernen ble slaktet og personlige MCA segmentene var samlet, montert og trykk. Som intraluminal trykket perfused gjennom arteriell segmentene ble redusert i 20 mmHg trinn fra 100 til 20 mmHg, ble MCA diameter målt og registrert. Med synkende intraluminal press, MCA diameter stadig økt betydelig over grunnlinjen i humbug bTBI grupper mens MCA dilator svar ble betydelig redusert (p < 0,05) i begge bTBI grupper som gjenspeiles av handikappede, mindre MCA diameter registrert for bTBI grupper. I tillegg RR undertrykkelse i bTBI gruppene var signifikant (p < 0,05) høyere enn i humbug bTBI grupper. MCA er samlet fra Sham bTBI grupper utstilt typiske vasodilatory egenskaper til nedgang i intraluminal press mens MCAS samlet etter bTBI utstilt betydelig svekket myogenic vasodilatory svar til redusert trykk faste i minst 60 minutter etter bTBI.
Lik som følger effekten (dvs., ikke-blast) TBI, blast-indusert traumatisk hjerneskade (bTBI) har vært forbundet med cerebral vaskulære skader1 og svekket cerebral vaskulær kompenserende Svar å forekomster som endringer i delvis presset av karbondioksid (PaCO2)2,3,4 og oksygen (Pão2)5. I tillegg har eksplosjon eksponering forårsaket cerebral arteriell vasospasme i dyr6 og bTBI pasienter7,8. Mens klinisk TBI9 og væske-perkusjon skade (FPI)10,11,12 er assosiert med svekket cerebral vaskulær svar til endringer i arterielt blodtrykk (dvs., Trykk autoregulation)9,10,11,12, usikkerhet igjen om effekten av bTBI på cerebral vaskulær press autoregulation kapasitet.
Cerebral sirkulasjon reagerer på variasjoner i systemisk arteriell trykk med hensikten å opprettholde en kontinuerlig oksygen og næringsstoffer levering levert til metabolically aktiv hjernen13,14,15, 16. En unik form for homeostase, autoregulation17,18,19 oppstår når “et organ opprettholder en konstant blodstrøm til tross for endringer i blodtrykk (perfusjon) eller andre fysiologiske eller patologisk stimuli” 20. cerebral arterier constrict eller dilate svar blodtrykk, nitrogenoksid (NO), blod viskositet, PaCO2 og Pão2, etc.4,11,16, 21. arterial myogenic svar refererer til slike sammentrekninger eller dilations. Myogenic vaskulære svaret, først beskrevet av Bayliss22 og store mekanisme bidra til autoregulation av CBF, er preget av vasokonstriksjon hvis perfusjon trykket øker og vasodilatation hvis perfusjon trykket reduseres 14 , 17. dette vaskulær svaret er iboende evne til kontraktile vev (som vaskulær glatt muskelceller, VSMC’S) å svare på strekke og/eller endringer i lumen og/eller vegg spenning23,24, 25,26,27,28,29. Når blodårene er strukket (f.eks, under intravascular trykket øker), VSMC’S constrict24,25,26,28.
Studier som undersøker motstand fartøy ex vivo har ofte ansatt en av to metoder for å teste egenskapene farmakologiske og fysiologiske isolert motstand fartøy: ring-montert metoden og den cannulated, trykk metoden. Ring-montert fartøy forberedelse metoden innebærer to ledninger gikk intraluminally gjennom fartøyet segmentet, som holder segmentet på plass. Måle mengden av kraften på isometrically vedvarende ledninger målere stimulering av VSMC’S. Men denne teknikken bærer med seg visse reservasjoner, særlig den uunngåelige skaden påført endothelial laget av lumen som ledningene er gått gjennom det30 og varierende grad av strekker påført isolert segment som igjen fører til fartøyet veggen distensjon, til slutt påvirker fartøyets følsomhet for farmakologisk agenter31. Cannulated, trykk fartøy forberedelse metodikken benytter en arteriograph består av to separate kammere som hver hus plasseringen av en midtre cerebral arteriell (MCA) høstet fra en enkelt dyr. Brønnene settes inn i hver ende av segmentet, den proksimale enden av segmentet er festet til brønnene med suturer og lumen er sakte parfyme med en fysiologisk saltløsning (PSS) for å fjerne blod og andre stoffer. Den klubbeformede enden er deretter sikret med suturer. Transmuralt eller luminal trykk ligger ved å heve to reservoarene knyttet til hver Pipetter til en egnet høyde over hvert segment, men ved ulike høyder med hensyn til de andre32,33,34,35 ,36. Trykk transdusere plassert langs reservoarer og Mikropipetter gir perfusjon automatiske blodtrykksmålinger mens fartøy forstørret bruker en invertert mikroskop utstyrt med en skjerm, videokamera og skalering tillater for måling av eksterne MCA diameter. Selv om begge metodene er verdifull, cannulated, trykkluft fartøy forberedelse metodikken bedre etterligner og tillatelser fartøyene undersøkt for å være nærmere sin i vivo forhold32,37.
Effekten av ulike typer innvirkning (dvs., ikke-blast) TBI cerebral vaskulær tiltak har tidligere vært undersøkt i cerebral arteriell segmenter21,35,36,38. Bruker en lignende ex vivo MCA protokollen for fartøyet innsamling, montering og perfusjon som beskrevet i denne studien, oppnådd tidligere studier suksess med sine respektive undersøkelser i de tilknyttede mekanismene av hjerne blodkar dysfunksjon følgende TBI. Golding et al.34 undersøkt endothelial-mediert dilations i voksen, mannlige lange-Evans rotte MCAS etter alvorlig TBI ved kontrollert kortikale innvirkning (CCI for) skade. I en annen studie, Golding et al.36 undersøkt cerebrovascular reaktivitet hypotensjon eller CO2 etter høsting MCAS fra rotter som opprettholdt en mild CCI. Yu et al.38 analysert om peroxynitrite renovasjonsarbeider forbedret dilatory reaksjoner til redusert intravascular trykket i voksen, mannlige Sprague-Dawley rotten MCA segmenter utsatt for FPI mens Mathew et al.21 studerte myogenic svar til hypotensjon i MCA er høstet etter moderat, sentrale FPI.
Bedre undersøke hypotesen at bTBI, som ikke-blast TBI, fører til svekket cerebral vaskulær reaktivitet, vi testet en mekanisme bidra til svekket autoregulation ved å måle myogenic dilatory reaksjoner til redusert intravascular trykk ex vivo i isolerte, trykksatt gnager MCA segmenter (figur 1) fra rotter utsatt for mild bTBI bruker en avansert Blast Simulator (ABS) sjokk tube modell (figur 2 og Figur 3) (se Rodriguez et al.39 Tabell 1) som bruker trykkluft levert direkte til en driver kammer å generere Freidlander-lignende40 over og under trykk bølger (se Rodriguez et al.39figur 1A).
Figur 1 : Plasseringen av midtre cerebral arteriene (MCA). Opprydning rotte hjernen utheving plasseringen av MCAS bakre hjerne arteriene (PCA), interne carotis arteriene (ICA), eksterne carotis arteriene (ECA), basilar arterien (BA) og felles carotis arteriene (CCA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Avansert Blast Simulator (ABS) sjokk rør enhet. ABS brukes til å produsere primære eksplosjon skader i alle studie dyr. 1 = driveren kammer; 2 = ekspansjon kammer; 3 = prøven kammer; 4 = reflektert bølge suppressor; gul stjerne = prøven skuffen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Som med alle protokoller og instruksjoner, er det viktig at enkelte trinn for protokollen i denne studien følges så nøyaktig og så nøyaktig som mulig. Etter den første intubasjon av rotte er det viktig å bekrefte at det puster jevnt og uten problemer. Feilaktig innsetting av endotracheal tube i spiserøret i stedet for luftrøret vil resultere i rasping, vanskelig åndedrag, blødning og den påfølgende fengende av rotte på grunn av mangelfull bedøvende levering til lungene.
Når taping mylar membran arkene over midten av åpningen mellom driveren og utvidelse kammer, er det viktig at arkene er sentrert og dekker hele åpne39,41. Misaligning ark over åpningen vil medføre luftlekkasje fra driveren kammer, en dråpe i nødvendige trykket for membran burst-potensielle og fornektelse av administrasjonen av eksplosjonen skaden. Riktig situating og sikkert passende tilbehør stål blokken mot hydraulisk håndpumpe blokk og driver kammeret er også viktig som er stramme hydraulisk hånden pumpen knotten og bekrefter driveren kammeret er fortsatt trykksatt uten lekkasjer. Riktig plassering av stål blokken kan driveren kammeret tett lukke mot ekspansjon kammeret, dermed skape obligatorisk segl behov over kammeret åpning av Mylar membran arkene og mellom driveren og utvidelse kammeret.
Under forberedelsene før MCA fartøyet utdrag, gassing PSS med nødvendige blanding av 21% O2 og 5% CO2 i en balanse av N2 equilibrates løsningen og forenkler necessitated nøytral fysiologisk pH nødvendig for en arbeider PSS løsning21,33,34.
Equilibrating segmentene ved konstant trykk for 60 min21,32,33,34 er svært obligatorisk som dette trinnet tillater segmentene til constrict følgende en maksimal dilatasjon vises under deres første primære pressurization. Denne hendelsen viser forekomsten av spontane tone, en egenskap som kan tyde på en sunn arterien32,33,34. Selv om diverse press nivåene for segmentet balanse har vært benyttet i andre studier33,34,42, denne studien og de av Mathew et al.21, Golding et al.35 og Golding et al.43 equilibrated segmentene på 50 mmHg. Mens equilibrating samlet segmenter hvor som helst mellom 40 mmHg – 100 mmHg32 tillater enkelte fleksibilitet og endringer for dette trinnet av protokollen, en time for balanse i parametrene trykk til slutt bekrefter sunn arteriene nødvendig for videreføring av eksperimentet.
Tar svært forsiktig når du fjerner hjernen fra skallen og venstre og høyre MCA segmentene fra sirkel av Willis mens beholder disse fartøyene er kanskje det mest kritiske trinnet av hele protokollen. Punktering hjernen med bein rongeurs, rive eller alvorlig strekking av segmentene under fjerning eller tilfeldigvis rykk fartøyene med kirurgisk spatelen når graving hjernen av skallen sluttfører til ødeleggelse av de høstes MCA, forårsaker ubrukelig segmenter og avviklet bruken av den arteries, til slutt renons hele eksperimentet for at dyr.
Om måling cerebral vaskulær svar på dilatory eller constrictory stimuli i MCA segmenter ex vivo samlet etter innvirkning eller eksplosjon TBI i vivo har gitt suksess, er metodene ikke uten sine problemer og/eller begrensninger. Kanskje en mer synlig kompleksiteten forbundet med å undersøke konsekvensene av TBI på blodsirkulasjonen i hjerne blodkar er koble eksplisitt effekten av TBI på skipene fra implisitt effektene oppstår på grunn av ulike og elementer som genereres av skadet hjernen44. Denne tenkelig forvirring kan potensielt være unngått ved å analysere ex vivo vasoconstrictory og vasodilatory reaksjoner av høstet, parfyme og/eller trykk MCA’S. I et forsøk på å redusere varigheten som cerebral arterier i vivo er utsatt for lokalt utladet parenchymal vasoactive materiale før døden, samling av cerebral arteriene direkte etter TBI kan minske graden av slike langvarig eksponering effekter. Ex vivo studier på isolerte MCA i tillegg presentere utsiktene til å analysere mekanismer for traumatisk vaskulære skader ved hjelp av bestemt reseptor agonister og antagonister eller anerkjente kjøretøy til vaskulære skader som ikke ville råd søkelys effektivt eller som diskriminerende vivo. Deretter kan dette ex vivo metoden kombineres med ex vivo-eksponering for narkotika å teste resulterende myogenic svar (vasokonstriksjon eller utvidelse av fartøyet segmentet på grunn av intravascular eller ekstravaskulær overvåking av narkotika eksponering).
Andre begrensninger omfatter omtrent eller utålmodig fjerne MCAS fra høstet hjernen som kan føre til tidlig rive av fartøyene, således renons bruken. I tillegg kan la mer enn noen få minutter gå mellom euthanasia av dyret, samling av fartøyene og deres plassering i PSS løsningen også oppheve sin levedyktighet. Når riktig utført og etterfulgt, kan er beskrevet i denne protokollen for å teste myogenic svar av MCAS når bTBI tar flere timer fra start til slutt og forsøk på å begrense tiden som kreves for suksess føre eksperimentelle feil. Men denne metoden er gjort i vitro og utnytter betydelig mer kostnadseffektiv instrumentering og utstyr enn i vivo høyoppløselig magnetisk resonans (MR) imaging45,46 eller konvensjonelle Doppler sonography / velocimetric teknikker47,48,49 som er også ansatt for fartøyet studier.
Disse funnene at milde bTBI skader er forbundet med nedsatt cerebral dilatory reaksjoner til redusert intravascular press kan være en funksjon av vasospasme6,7 og VSMC hyperconstriction50 tidligere rapportert etter eksplosjon eksponering slutt fører til forekomster som redusert relative cerebral perfusjon. I tillegg kunne blast-indusert skade hindrer normal dilatory reaksjoner er hjerne blodkar muligens fremme ytterligere reduksjoner i cerebral perfusjon kombinert med arteriell hypotensjon, en hyppig forekomst under kampoperasjoner.
Disse resultatene indikerer at bTBI resulterer i en endring til mekanismer tilrettelegge arterielle vaskulære kontroll. Akutt fase cerebral vaskulær svekkelse av arteriell myogenic svar reduksjoner i intravascular press for minst en time etter skade ble observert, forblir det hull i informasjon omkring den akutte fasen etter bTBI. Betydningen av å identifisere hva fysiske og biokjemiske mangler skader er cerebral blodkar og hjernen eksponering bTBI årsaker kan hjelpe bestemme hvor terapeutiske og/eller rehabiliterende suksess ganske umiddelbart etter skade.
The authors have nothing to disclose.
Studier ble gjennomført som del av et team som støttes av Moody Project for Traumatisk Brain skader translasjonsforskning og pris W81XWH-08-2-0132 fra den amerikanske hæren medisinsk forskning og materiale kommando – Forsvarsdepartementet.
Advanced Blast Simulator (ABS) | Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. | N/A | Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries |
Adult, male, Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | N/A | Experimental animals |
Arteriograph | Living Systems Instrumentation, Inc. | Arteriograph | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Bone rongeurs, large | FST Fine Science Tools | Friedman Rongeur | Brain extraction from skull |
Bone rongeurs, small | FST Fine Science Tools | Boynton Rongeur | Brain extraction from skull |
CaCl2 | Sigma | Calcium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Ear plugs | 3M | Foam Ear Plugs 1100 Class AL | Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine |
Glucose | Sigma | D-[+]-Glucose | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | Isoflurane, USP | Anesthetic |
KCl | Sigma | Potassium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
MgSO4•7H2O | Sigma | Magnesium sulfate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Microforceps | Buxton Biomedical Inc. | Micro Tying Fcps, 180mm | Brain extraction from skull |
Mylar sheets | Texas Art Supply | Mylar | Membrane used for compressed air build-up during blasting |
NaCl | Sigma | Sodium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
NaHCO3 | Sigma | Sodium bicarbonate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Nylon suture | Ethicon | 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Scalpel blade #10 | Bard-Parker | 10 Stainless Steel Surgical Blade | Brain extraction from skull |
Surgical spatula | Delmaks Surgico | Cement Spatula | Brain extraction from skull |
Thermometer | Physitemp Instruments, Inc., | Thermalert Monitoring Thermometer | Monitoring of experimental animal's core body temperature |
Volume ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | Small Animal Ventilator | Constant and steading breathing of the intubated experimental animal |
Water blanket | Gaymar Industries, Inc. | Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad | Maintenance of experimental animal's body temperature |