Här presenterar vi ett protokoll för att beskriva metoder för ex vivo vaskulär reaktivitet bestämning efter en primär blast traumatisk hjärnskada (bTBI) med hjälp av isolerade, trycksatt och gnagare mellersta cerebral arteriell (MCA) segment. bTBI induktion sker med hjälp av en shock tube, även känd som en avancerad Blast Simulator (ABS)-enhet.
Även om det har gjorts studier på histopatologisk och beteendemässiga effekter av blast exponering, har färre tillägnats blast’s cerebrala vaskulära effekter. Inverkan (dvs., icke-blast) traumatisk hjärnskada (TBI) är kända för att sänka trycket självregleringen i den cerebrala kärl hos både människor och försöksdjur. Hypotesen att blast-inducerad traumatisk hjärnskada (bTBI), som påverkar TBI, resulterar i försämrad cerebral vaskulär reaktivitet testades genom att mäta myogenic förhalande Svaren till reducerat intravaskulär tryck i gnagare mellersta cerebral arteriell (MCA) segment från råttor som utsätts för mild bTBI med hjälp av en avancerad Blast Simulator (ABS) chock röret. Vuxen, manlig Sprague-Dawley-råttor var sövda, intuberade, ventilerat och förberett för Sham bTBI (identiska manipulation och anestesi utom blast skada) eller mild bTBI. Råttor har randomiserats till Sham bTBI eller mild bTBI följt av offer 30 eller 60 min efter skada. Omedelbart efter bTBI, rätande reflex (RR) dämpning gånger bedömdes, dödshjälp på den tid punkter efter skadan slutfördes, hjärnan skördades och de enskilda MCA-segmenten samlades, monterad och trycksatt. Som intraluminal trycket perfusion via arteriell segment minskades i 20 mmHg steg från 100 till 20 mmHg, var MCA diametrar mäts och registreras. Med minskande intraluminal tryck, MCA diametrar stadigt ökat markant över baslinjen i Sham bTBI grupper medan MCA dilatator Svaren var signifikant (p < 0,05) i båda bTBI grupperna vilket framgår av den nedsatt, mindre MCA diametrar registreras för bTBI grupper. Dessutom RR dämpning i bTBI grupperna var signifikant (p < 0,05) högre än i Sham bTBI grupper. MCA är samlat från de Sham bTBI grupper utställda typiska vasodilaterande egenskaper för minskar i intraluminal trycket medan MCAS samlas in efter bTBI uppvisade signifikant nedsatt myogenic vasodilaterande Svaren till minskade trycket som kvarstod i minst 60 min efter bTBI.
Liknande som följer av inverkan (dvs., icke-blast) TBI, blast-inducerad traumatisk hjärnskada (bTBI) har varit associerade med cerebral vaskulär skada1 och nedsatt cerebral vaskulär kompenserande Svaren till händelser som förändringar i partialtrycket av koldioxid (PaCO2)2,3,4 och syre (PaO2)5. Dessutom har blast exponering orsakade cerebral arteriell vasospasm i djur6 och bTBI patienter7,8. Medan kliniska TBI9 och vätska-slagverk skada (FPI)10,11,12 är associerade med försämrad cerebral vaskulär svar på förändringar i arteriellt blodtryck (dvs., Tryck självregleringen)9,10,11,12, osäkerhet kvarstår när det gäller effekterna av bTBI på cerebral kärltryck självregleringen kapacitet.
Den cerebral cirkulationen reagerar på variationer i systemiska arteriella trycket med avsikt att upprätthålla en kontinuerlig syre och näringstillförsel som levereras till den metaboliskt aktiva hjärnan13,14,15, 16. En unik typ av homeostas, självregleringen17,18,19 uppstår när ”ett organ upprätthåller en konstant blodflöde trots förändringar i blodtryck (perfusion) eller andra fysiologiska eller patologiska stimuli” 20. cerebrala artärer tygla eller vidgas svar på variationer i blodtryck, kväveoxid (NO), blodets viskositet, PaCO2 och PaO2etc.4,11,16, 21. arteriell myogenic svar avser sådana sammandragningar eller utspädningar. Den myogenic vaskulär respons, som först beskrevs av Bayliss22 och en viktig mekanism som bidrar till självregleringen av CBF, kännetecknas av vasokonstriktion om perfusionstrycket ökar och vasodilatation om perfusionstrycket minskar 14 , 17. detta vaskulär respons är kontraktila vävnader (t ex vaskulära glatta muskelceller, VSMC’S) inneboende förmåga att svara att sträcka och/eller förändringar i lumen eller vägg spänningen23,24, 25,26,27,28,29. När artärerna är sträckta (t.ex., under intravaskulär trycket ökar), VSMCS tygla24,25,26,28.
Studier som undersöker motstånd fartyg ex vivo har allmänt används en av två metoder för att testa den farmakologiska och fysiologiska egenskaper för isolerade motstånd fartyg: metoden ring-monterad och den kanylerade, trycksatt metod. Ring-monterad fartyget förberedelse metoden innebär att två trådar som gått intraluminally genom segmentet fartyg, som håller segmentet på plats. Mäta mängden kraft som anbringas på isometrically ihållande trådarna mätare stimulering av VSMC. Men denna teknik bär med sig vissa reservationer, framför allt, den oundvikliga skada som lidits av endothelial lagret av lumen när kablarna är passerade genom det30 och varierande grad av stretching av segmentet isolerade vilket i sin tur leder till fartyget vägg buk, som i slutändan påverkar fartygets känslighet för farmakologiska medel31. Den kanylerade, trycksatta fartyget förberedelse metoden använder tredjeparts en arteriograph som består av två separata kammare som varje hus placeringen av en mellersta cerebral arteriell (MCA) skördas från ett enskilt djur. En mikropipett infogas i varje ände av segmentet, den proximala änden av segmentet är fäst till mikropipett med suturer och lumen är mjukt perfusion med en fysiologisk saltlösning (PSS) för att eliminera blod och andra ämnen. Den distala änden fästs sedan med suturer. Transmural eller luminala tryckbärande ställs genom att höja de två reservoarer som bifogas varje pipett till lämplig höjd ovanför varje segment men på olika höjder med avseende på de andra32,33,34,35 ,36. Tryckgivare placerad längs reservoarer och Mikropipetter ge perfusion tryckmätningarna medan fartyg förstoras genom en inverterade Mikroskop har en monitor, video kamera och scaler som möjliggör mätning av externa MCA diametrar. Även om båda metoderna är värdefull, den kanylerade, trycksatta fartyget förberedelse metoden bättre härmar och tillstånd kärlen undersökas för att komma närmare deras in vivo villkor32,37.
Effekterna av olika typer av påverkan (dvs., icke-blast) TBI på cerebral vaskulär Svaren har tidigare studerats i cerebral arteriell segment21,35,36,38. Tidigare studier med liknande ex vivo MCA protokoll för fartyget insamling, montering och perfusion som beskrivs i den aktuella studien, och erhålls framgång med deras respektive utredningar av de associera mekanismerna av cerebral vaskulatur dysfunktion efter TBI. Golding et al.34 undersökta endothelial-medierad utspädningars vuxen, manlig lång-Evans råtta MCA efter svår TBI genom kontrollerad kortikal påverkan (CCI) skada. I en andra studie, Golding et al.36 undersökt cerebrovaskulär reaktivitet till hypotoni eller CO2 efter skörd MCAS från råttor som lidit en mild CCI. Yu et al.38 analyseras huruvida peroxynitrit asätare förbättrad förhalande svar på minskad intravaskulär trycket i vuxen, manlig Sprague-Dawley råtta MCA segment utsätts för FPI medan Mathew et al.21 studerade myogenic Svaren till hypotension hos MCA är skördas efter måttlig, centrala FPI.
För att bättre undersöka hypotesen att bTBI, som icke-blast TBI, resulterar i försämrad cerebral vaskulär reaktivitet, vi testade en mekanism som bidrar till komprometterad självregleringen genom att mäta myogenic förhalande Svaren till reducerat intravaskulär tryck ex vivo i isolerade, trycksatt gnagare MCA segment (figur 1) som samlats in från råttor som utsätts för mild bTBI använder en avancerad Blast Simulator (ABS) shock tube modell (figur 2 och figur 3) (se Rodriguez et al.39 Tabell 1) som använder tryckluft som levereras direkt till en drivrutin kammare att generera Freidlander-liknande40 över – och under – pressure vågor (se Rodriguez et al.39figur 1A).
Figur 1 : Platsen för mellersta cerebrala artärer (MCA). Ventral vy över råtthjärna markera platsen för MCAS i förhållande till den bakre cerebrala artärer (PCA), interna halspulsåder (ICA), yttre halspulsåder (ECA), basilaris artär (BA) och gemensamma halspulsåder (CCA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Avancerad Blast Simulator (ABS) shock tube enhet. ABS används för att producera primära blast skada i alla studie djur. 1 = föraren kammare; 2 = expansionskammare; 3 = prov kammare; 4 = reflekterade våg suppressor; gula stjärnor = preparatet fack. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Som med alla protokoll och instruktioner, är det absolut nödvändigt att vissa steg för protokollet i denna särskilda undersökning följs så exakt och så exakt som möjligt. Efter den inledande intubation av råtta är det viktigt att bekräfta att det är att andas lugnt och utan svårighet. Av misstag sätter endotrakealtub i matstrupen i stället för luftstrupen resulterar i rasping, svårt andetag, blödning och den efterföljande medryckande råttans på grund av bristfällig smärtlindring leverans till lungorna.
När tejpning mylar membranet täcker över centrum av öppningen mellan föraren och expansion kammaren, är det nödvändigt att arken är centrerade och täcker hela öppning39,41. Misaligning täcker över öppningen kommer att resultera i luftläckage från föraren kammaren, en droppe i erforderligt tryck för burst-membranpotentialen och förnekande av administrationen av den blast skadan. Korrekt placera och säkert passande tillbehör stål blocket mot hydraulisk handpump block och föraren avdelningen är också viktigt som är åtdragning hydraulisk hand pumpen vredet och bekräftar driver kammaren förblir trycksatt utan läckor. Korrekt placering av stålblockets tillåter föraren kammaren till tätt nära mot den expansionskammare, vilket skapar den obligatoriska tätningen krävs över kammaren öppning av Mylar membran arken och mellan föraren och expansion kammaren.
Under förberedelserna innan de MCA fartyget extraktioner, gasning PSS med nödvändiga blandningen av 21% O2 och 5% CO2 i en balans av N2 balanserar lösningen och underlättar necessitated neutrala fysiologiska pH behövs för en arbetar PSS lösning21,33,34.
Equilibrating segmenten på ett konstant tryck för 60 min21,32,33,34 är extremt obligatoriskt eftersom detta steg tillåter segmenten att tygla följande en maximal dilatation visas under deras första primära trycksättning. Denna händelse visar förekomsten av spontana tonen, en egenskap som tyder på en frisk artär32,33,34. Även om diverse trycknivåer för segmentet Jämviktstiden använts i andra studier33,34,42, denna studie och de av Mathew et al.21, Golding et al.35 och Golding et al.43 jämviktas segmenten på 50 mmHg. Medan equilibrating insamlade segment någonstans mellan 40 mmHg – 100 mmHg32 möjliggör vissa flexibilitet och modifiering för steget i protokollet, en Jämviktstiden timmarsperiod inom de parametrarna som tryck slutligen bekräftar friska artärer behövs för fortsätta experimentet.
Ta extrem försiktighet när du tar bort hjärnan från skallen och de vänstra och högra MCA-segment från den Circle of Willis samtidigt som dessa fartyg intakt är kanske det viktigaste steget i hela protokollet. Punktera hjärnan med den ben rongeurs, kommer att riva eller svår stretching av segmenten under borttagning eller av misstag dra kärlen med kirurgisk spateln när grävning hjärnan ur skallen slutändan resultera i förstörelsen av den avver- MCA’S, orsakar oanvändbar segment och avbröt användning av denna uppsättning artärer, slutligen tömning hela experimentet för detta djur.
Även mäta cerebral vaskulär Svaren till förhalande eller constrictory stimuli i MCA segment ex vivo samlas in efter effekt eller blast TBI Invivo har gett framgång, är metoden inte utan dess svårigheter eller begränsningar. Kanske en av mer märkbara komplexiteten kopplad till att undersöka konsekvenserna av TBI om avyttring av de cerebrala kärl du lossar TBI explicit effekter på fartyg från implicita effekterna som uppstår på grund av de olika material och element som genereras av de skada hjärnan44. Denna tänkbara rådlöshet kan potentiellt kringgås genom att analysera ex vivo vasoconstrictory och vasodilaterande reaktioner skördas, perfusion och/eller trycksatt MCA’S. I ett försök att minska varaktigheten av tid som cerebrala artärer i vivo utsätts för lokalt urladdat parenkymal vasoaktiva materialet före döden, samling av cerebrala artärer direkt efter TBI kan minska graden av sådan långvarig exponering effekter. Ex vivo-studier på isolerade MCAS dessutom presentera utsikterna att analysera mekanismer av traumatisk vaskulär skada genom användning av särskilda receptoragonister och antagonister eller välrenommerade fordon av vaskulär skada som inte skulle ha råd med granskning som effektivt eller som diskriminerande i vivo. Därefter kan detta ex vivo metoden kombineras med ex vivo exponering för droger att testa resulterande myogenic svaren (vasokonstriktion eller dilatation av kärl segment på grund av intravaskulär eller extravaskulär läkemedelsexponering).
Andra begränsningar är ungefär eller otåligt att ta bort MCAS från skördade hjärnan vilket kan resultera i förtida avrivning av fartygen, således upphäva deras användning. Dessutom att låta mer än ett par minuter förflyta mellan avlivning av djuret, samling av fartygen och deras placering i den beredda PSS-lösningen kan också att förneka deras livskraft. När korrekt utfört och följde, kan de metoder som beskrivs i detta protokoll för provning av MCA’S myogenic svar efter bTBI tar flera timmar från början till slut och försök till inskränka tidsperiod som krävs för framgång resultera i experimental misslyckande. Men denna metod är gjort in vitro- och utnyttjar betydligt mer kostnadseffektiv instrumentering och utrustning än Invivo högupplösta magnetresonans (MR) imaging45,46 eller konventionella Doppler sonography / velocimetric tekniker47,48,49 som också är anställd för fartyget studier.
Dessa fynd att mild bTBI skada är associerade med försämrad cerebral förhalande Svaren till reducerat intravaskulär tryck kan potentiellt vara en funktion av vasospasm6,7 och VSMC hyperconstriction50 tidigare rapporterade efter blast exponering som i slutändan leder till förekomster såsom minskad relativ cerebral perfusion. Dessutom kunde blast-inducerad skada hindrar normala förhalande reaktioner av de cerebrala vaskulatur möjligen främja ytterligare sänkningar av cerebral perfusion i kombination med arteriell hypotension, en frekvent förekomst under stridsoperationer.
Dessa resultat indikerar att bTBI resulterar i en förändring till de mekanismer som underlättar arteriell vaskulär kontroll. Även om akut-fas cerebral vaskulär försämring av arteriell myogenic svar på minskningar av intravaskulär trycket för minst en timme efter skada observerades, fortfarande finns luckor i informationen kring den akuta fasen efter bTBI. Vikten av att identifiera vilka fysiska och biokemiska brister skador att den cerebrala vaskulatur och hjärnan exponering för bTBI orsaker kunde stöd i fastställandet av terapeutiska och rehabiliterande framgång ganska omedelbart efter skada.
The authors have nothing to disclose.
Studier avslutades som en del av ett team som stöds av The Moody Project för translationell traumatisk skada hjärnforskning och W81XWH-08-2-0132 award från US Army Medical Research och Material kommando – försvarsdepartementet.
Advanced Blast Simulator (ABS) | Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. | N/A | Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries |
Adult, male, Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | N/A | Experimental animals |
Arteriograph | Living Systems Instrumentation, Inc. | Arteriograph | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Bone rongeurs, large | FST Fine Science Tools | Friedman Rongeur | Brain extraction from skull |
Bone rongeurs, small | FST Fine Science Tools | Boynton Rongeur | Brain extraction from skull |
CaCl2 | Sigma | Calcium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Ear plugs | 3M | Foam Ear Plugs 1100 Class AL | Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine |
Glucose | Sigma | D-[+]-Glucose | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | Isoflurane, USP | Anesthetic |
KCl | Sigma | Potassium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
MgSO4•7H2O | Sigma | Magnesium sulfate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Microforceps | Buxton Biomedical Inc. | Micro Tying Fcps, 180mm | Brain extraction from skull |
Mylar sheets | Texas Art Supply | Mylar | Membrane used for compressed air build-up during blasting |
NaCl | Sigma | Sodium chloride | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
NaHCO3 | Sigma | Sodium bicarbonate | Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS) |
Nylon suture | Ethicon | 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) | Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter |
Scalpel blade #10 | Bard-Parker | 10 Stainless Steel Surgical Blade | Brain extraction from skull |
Surgical spatula | Delmaks Surgico | Cement Spatula | Brain extraction from skull |
Thermometer | Physitemp Instruments, Inc., | Thermalert Monitoring Thermometer | Monitoring of experimental animal's core body temperature |
Volume ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | Small Animal Ventilator | Constant and steading breathing of the intubated experimental animal |
Water blanket | Gaymar Industries, Inc. | Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad | Maintenance of experimental animal's body temperature |