Tilskyndelse og evaluering af en Murine Model af eksperimentelle nærsynethed

Summary

I denne protokol beskriver vi den fulde proces af eksperimentelle nærsynethed tilskyndelse i mus med nydesignede briller og den teknik, der er nødvendige for at opnå stabil og reproducerbare resultater i okulær parameter målinger.

Abstract

Murine model af nærsynethed kan være et effektivt redskab for nærsynethed forskning på grund af den forholdsvis let genmanipulation. Én måde at fremkalde nærsynethed i dyr er at sætte klare minus linser foran øjnene for uger (linse-induceret nærsynethed, LIM). Men bevarede protokoller for tilskyndelse og evaluering varierer fra laboratorium til laboratorium. Her, beskrevet vi en meget praktisk og reproducerbar metode til at fremkalde LIM i mus med nydesignede briller. Metode rettelser linse stabilt foran musen øjet samtidig giver mulighed for linsen at være taget ud til rengøring eller aktuelle medicin administration. Fænotype er robuste og effektive, og afvigelsen er lille. Metoden beskrives her kan anvendes på mus lige efter fravænning, som udvider den mulige varighed for eksperimenter. Vi gav også teknisk rådgiver for reproducerbare resultater i brydning og aksial længde målinger. Vi håber den trinvise protokollen beskrevet her og detaljeret artiklen kan hjælpe forskerne med at udføre nærsynethed eksperimenter med nærsynethed mere smidigt og gøre dataene sammenlignelige på tværs af laboratorier.

Introduction

Forekomsten af nærsynethed er steget dramatisk for nylig, mens mekanismen af dens debut og progression er stadig i vid udstrækning unknow¹. Den mest karakteristiske Fænotypen af nærsynethed er strækning af aksial længde (AL), hvilket øger risikoen for retinal komplikationer eller endda blindhed². For bedre at forstå patogenesen af nærsynethed og udvikle effektive behandlinger, er robust nærsynet dyremodeller og stabil fænotype evaluering nødvendig.

Kort, to metoder eksisterer for at fremkalde nærsynet stater i dyr: form-afsavn Nærsynethed (FDM) og linse-induceret Nærsynethed (LIM)³. Førstnævnte steder diffusorer foran øjet eller sutures øjenlåg for at sløre billedet, som påvirker den normale udvikling af øjeæblet, hvilket resulterer i en nærsynethed fænotype. De sidstnævnte steder minus linser foran øjet flytte omdrejningspunkt bag nethinden. Nethinden registrerer en forskydning af fokus og elongates øjeæblet for at justere nethinden og omdrejningspunkt. For FDM, efter øjenlåget er lukket eller diffuser har været fast foran øjet, er næsten ingen yderligere vedligeholdelse nødvendig. Linsen skal tages af for rensning for at holde det gennemsigtige for LIM. FDM er således relativt let at være induceret teknisk. Men mekanismerne af FDM og LIM er forskellige, og hvilken metode efterligner nærsynethed i menneskelige bedre er stadig under debat³. En af styrkerne ved LIM er stærkere fænotype sammenlignet med FDM, i det mindste i forbindelse med mus⁴.

Dyr, der har været anvendt for at fremkalde nærsynethed omfatter kyllinger⁵, aber⁶, tree spidsmus⁷, marsvin⁸og mus⁴. I betragtning af muligheden for genmanipulation, rigelige tilgængelige antistoffer og lave omkostninger til avl, kunne mus have været førstevalg som dyremodel for nærsynethed. Sammenlignet med andre større dyr, er fastsættelse linser eller diffusorer foran musen øjet dog relativt vanskeligt især for unge mus som lige efter fravænning. For de eksperimenter, der har brug for aktuel drug administration eller flere mellemliggende øje målinger, er det også nødvendigt, at rammen skal være flytbare. En anden udfordring er den lille morfologisk ændring af mus øjeæblet, som har bør for avancerede teknik og enheder til at evaluere. Til dato har forskellige inducerende og måling af protokoller, der bruges i forskellige forskningsgrupper gør det svært at sammenligne og gentage resultaterne på tværs af laboratorier. En standardprotokol med detaljer er nødvendig.

Tidligere værker beskrives flere metoder til at løse linser eller diffusorer foran musen øjet, såsom limning⁹, syning¹⁰ og hoved-monteret goggle frame^11,12. Vi kombineret exist hovedmonteret goggle technics^11,12,13 med vores nydesignede ramme til at udvikle en afhjælpes protokol for at fremkalde robust og effektiv eksperimentelle nærsynethed i mus. Protokollen kan anvendes til unge mus snarest efter fravænning på postnatal dag 21 (p21). Vi har også optimeret processerne for stabil og præcis vurdering af fænotyper herunder brydning og AL. Vi håber, denne standardiseret protokol kan bidrage til at gøre nærsynet mus en mere lettilgængelig model for nærsynethed forskning.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af den etiske komité på Animal forskning af Keio University School of Medicine fulgt atomteknologileverandørernes sætningen ARVO brug af dyr i Ophthalmic og Vision forskning, den institutionelle retningslinjer på dyret eksperimenter på Keio Universitet, og dyret forskning: rapportering af i Vivo eksperimenter (kommer) retningslinjer for brug af dyr i forskning. 1. montering af briller til mus Forberede dele nødvendige for montage briller (<strong …

Representative Results

At kontrollere først, hvis alle de nødvendige dele er udarbejdet (figur 1a). Et eksempel på et stykke af samlet briller er vist i figur 1b. Bortset fra hoveddelen af rammer og møtrikken er alle andre dele disponible for hvert mus. Et sæt af færdige briller er vist i figur 1 c. Ændre vinklen mellem de to billeder til at passe med musen med forskellige aldre. <p class="jove_content" fo:keep-…

Discussion

For at sikre, at briller skal fastsættes stabilt på musen hovedet, skal flere trin i denne protokol være stor opmærksomhed. Periosteum skal fjernes helt før ved hjælp af dental selvklæbende system. Blod på kraniet skal også renses op med omhu. Mens en lille finjustering er acceptabelt lige efter påføring af limen, Flyt ikke stick ofte før den selvklæbende system tørre op. Følg instruktion af den selvklæbende system omhyggeligt, især forholdet mellem hver enkelt komponent af den endelige blanding. Hvornå…

Materials

screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan