Aplicación y evaluación de un modelo murino de miopía Experimental

Summary

En este protocolo, describimos el proceso completo de gafas de inducción en ratones usando nuevo diseñada experimental de miopía y la técnica necesaria para el logro de resultados estables y reproducibles en las mediciones de parámetros oculares.

Abstract

Modelo murino de la miopía puede ser una poderosa herramienta para la investigación de la miopía debido a la relativamente fácil manipulación genética. Una forma de inducir miopía en animales es poner claro menos lentes al frente de los ojos durante semanas (inducida por la lente de miopía, LIM). Sin embargo, han conservado protocolos de inducción y evaluación varían de laboratorio a laboratorio. Aquí, describimos un método muy práctico y reproducible para inducir anteojos LIM en ratones con nuevo diseñada. Las correcciones del método el objetivo estable frente a los ojos de ratón mientras que permite la lente a quitarse para la limpieza o tópico drogas administración. El fenotipo es robusto y eficiente, y la varianza es pequeña. El método aquí descrito puede aplicarse a los ratones justo después del destete que extiende la duración posible para los experimentos. También dimos técnica aconseja para lograr resultados reproducibles en refracción y medición de longitud axial. Esperamos el protocolo paso a paso descrito aquí y el artículo detallado puede ayudar a los investigadores a realizar experimentos de miopía con miopía más suavemente y hacer los datos comparables entre laboratorios.

Introduction

La prevalencia de la miopía ha aumentado drásticamente recientemente, mientras que el mecanismo de su aparición y la progresión son todavía en gran parte desconocido¹. El fenotipo más característico de la miopía es el alargamiento de la longitud axial (AL), que aumenta el riesgo de complicaciones retinianas o incluso ceguera². Para mejor comprender la patogénesis de la miopía y desarrollar tratamientos eficaces, robustos modelos animales miopes y evaluación del fenotipo estable son necesarios.

Brevemente, existen dos métodos para inducir estados miopes en animales: forma privación miopía (FDM) y miopía inducida por la lente (LIM)³. El primero coloca difusores delante de los ojos o suturas de los párpados para ocultar la imagen, que influye en el desarrollo normal del globo ocular, resultando en un fenotipo de miopía. Los últimos lugares menos lentes delante del ojo para mover el punto focal detrás de la retina. La retina detecta el cambio del foco y alarga el globo ocular para realinear la retina y el punto focal. FDM, después de que el párpado se cierra o se ha solucionado el difusor delante del ojo, casi ningún tipo de mantenimiento adicional es necesario. Para LIM, el objetivo debe quitarse para la limpieza para mantener transparente. Así, es relativamente fácil inducir técnicamente FDM. Sin embargo, los mecanismos de la FDM y LIM son diferentes, y el mejor método que imita la miopía en humanos sigue siendo objeto de debate³. Uno de los puntos fuertes de LIM es el fenotipo más fuerte en comparación con FDM, por lo menos en el caso de ratones⁴.

Animales que se han utilizado para inducir la miopía incluyen pollos⁵, monos⁶, las musarañas de árbol⁷, conejillos de Indias⁸y ratones⁴. Teniendo en cuenta la posibilidad de manipulación genética, abundantes anticuerpos disponibles y bajo costo para la cría de ratones podrían haber sido la primera opción como el modelo animal de la miopía. Sin embargo, en comparación con otros animales más grandes, fijación de lentes o difusores delante de los ojos de ratón es relativamente difícil especialmente para los jóvenes ratones como derecho después del destete. Para los experimentos que necesitan la administración de medicamentos tópicos o múltiples medidas provisionales ojo, también es necesario para el marco a ser extraíble. Otro reto es el cambio morfológico pequeño del globo del ojo de ratón, que requiere sofisticadas técnicas y dispositivos para evaluar. Hasta la fecha, induciendo diferentes y protocolos utilizados en equipos de investigación diferentes de medición hacen difícil comparar y repetir los resultados a través de laboratorios. Es necesario un protocolo estándar con detalles.

Trabajos anteriores describen varios métodos para fijar lentes o difusores delante del ojo de ratón, como pegar⁹, costura¹⁰ y montado en la cabeza los anteojos marco^11,12. Combinamos gafas montado en la cabeza existen técnicas^11,12,13 con nuestro marco de nuevo diseño para el desarrollo de un protocolo ameliorated para inducir miopía experimental robusta y eficaz en ratones. El protocolo se puede aplicar a ratones jóvenes pronto después del destete en el día postnatal 21 (p21). También hemos optimizado los procesos para la evaluación precisa y estable de fenotipos como la refracción y AL. Esperamos que este protocolo estandarizado puede ayudar a hacer ratones miopes un modelo más accesible para la investigación de la miopía.

Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética en investigación Animal de la Facultad de medicina de la Universidad de Keio se adhirió a la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica y la investigación de visión, las directrices institucionales sobre animales de experimentación en Keio Universidad y la investigación Animal: informes de en Vivo experimentos (llegar) directrices para el uso de animales en investigación. 1. montaje de los anteojos para rat…

Representative Results

En primer lugar, compruebe si todas las piezas están preparadas (Figura 1a). En la Figura 1bse muestra un ejemplo de un pedazo de anteojos montados. Excepto el cuerpo principal de los marcos y la tuerca, todas las demás partes son desechables para cada ratón. Un conjunto de lentes completadas se muestra en la figura 1C. Cambiar el ángulo entre los dos bastidores para el ratón con diferentes edad…

Discussion

Para asegurarse de que las gafas de fijación estable de la cabeza de ratón, varios pasos en este protocolo deben prestarse gran atención. El periostio debe eliminarse completamente antes de usar el sistema adhesivo dental. La sangre en el cráneo también deben limpiarse con cuidado. Mientras que una pequeña puesta a punto es aceptable después de la aplicación del adhesivo, no mueva el palo con frecuencia ante el sistema de adhesivo seco para arriba. Siga las instrucciones del sistema adhesivo cuidadosamente, espec…

Materials

screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan