Aansporing en evaluatie van een lymfkliertest Model van experimentele bijziendheid
Summary
In dit protocol beschrijven we het volledige proces van experimentele bijziendheid aansporing in muizen met nieuw ontworpen brillen en de techniek die nodig is voor het bereiken van stabiele en reproduceerbare resultaten in oogbeschadigingen en/of parameter metingen.
Abstract
Lymfkliertest model van bijziendheid kunnen een krachtig hulpmiddel voor bijziendheid onderzoek vanwege de relatief gemakkelijke genetische manipulatie. Unidirectioneel voor het opwekken van bijziendheid in dieren is om duidelijke min lenzen voor ogen voor weken (lens-geïnduceerde bijziendheid, LIM). Bestaande protocollen voor aansporing en evaluatie verschillen echter van laboratorium tot laboratorium. We beschreven hier, een zeer praktische en reproduceerbare methode om te induceren LIM in muizen met nieuw ontworpen brillen. De methode correcties de lens stabiel voor het oog van de muis terwijl de lens worden gehaald voor het reinigen of actuele kunt drug administration. Het fenotype is robuust en efficiënt, en de variantie is klein. De hier beschreven methode kan worden toegepast op muizen direct na het spenen dat zich uitstrekt van de mogelijke duur voor experimenten. Ook gaven wij technische adviseert om reproduceerbare resultaten in breking en axiale lengte metingen te bereiken. Wij hopen het stapsgewijze protocol hier beschreven en de gedetailleerde artikel onderzoekers bijziendheid experimenten met bijziendheid soepeler uitvoeren en de gegevens vergelijkbaar te maken over laboratoria kan helpen.
Introduction
De prevalentie van bijziendheid onlangs dramatisch is toegenomen, hoewel het mechanisme van het ontstaan en de progressie nog grotendeels onbekend1. Het meest kenmerkende fenotype van bijziendheid is de rek van axiale lengte (AL), waardoor het risico voor de retinale complicaties of zelfs blindheid2. Om beter te begrijpen van de pathogenese van bijziendheid en ontwikkelen effectieve behandelingen, zijn robuuste bijziend diermodellen en stabiele fenotype evaluatie noodzakelijk.
Kort, bestaan twee methoden voor inducerende bijziend Staten in dieren: formulier-ontbering bijziendheid (FDM) en lens-geïnduceerde bijziendheid (LIM)3. De voormalige plaatst diffusors voor het oog of sutures van het ooglid om te verbergen de afbeelding, die invloeden van de normale ontwikkeling van de oogbol, resulterend in een fenotype van bijziendheid. De laatste plaatsen min lenzen voor het oog om te verplaatsen het brandpunt achter het netvlies. Het netvlies detecteert de verschuiving van de focus en kieuwopeningenvorm van de oogbol u kunt opnieuw uitlijnen de retina en brandpunt. Voor FDM, nadat het ooglid is gesloten of de diffuser is vastgesteld voor het oog, is bijna geen verder onderhoud nodig. LIM moet de lens worden genomen voor het schoonmaken zodat het transparant. FDM is dus relatief eenvoudig te technisch worden geïnduceerd. Echter, de mechanismen van FDM en LIM zijn verschillend, en welke methode bootst de bijziendheid in de mens beter is nog steeds onder debat3. Een van de sterke punten van LIM is het sterker fenotype vergeleken met FDM, ten minste in het geval van muizen4.
Dieren die zijn gebruikt voor bijziendheid inducerende omvatten kuikens5, apen6, boom spitsmuizen7, cavia’s8en muizen4. Rekening houdend met de mogelijkheid van genetische manipulatie, overvloedig beschikbaar antilichamen en lage kosten voor de fokkerij, kunnen muizen zijn de eerste keuze als de diermodel van bijziendheid. Vergeleken met andere grotere dieren, is vaststelling van lenzen of diffusors voor het oog van de muis echter relatief moeilijk vooral voor jonge muizen zoals recht na het spenen. Voor de experimenten moeten actuele drug administration of meerdere tussentijdse oog-metingen, is het ook noodzakelijk voor het frame worden verwijderd. Een andere uitdaging is de kleine morfologische verandering van muis oogbol, waarvoor geavanceerde techniek en apparaten te evalueren. Tot op heden maakt verschillende inducerende en het meten van de protocollen die worden gebruikt in verschillende onderzoeksteams het moeilijk om te vergelijken en herhaal de resultaten over laboratoria. Een standaard protocol met details nodig is.
Voorgaande werken beschreven meerdere methoden om op te lossen lenzen of diffusors voor het oog van de muis, zoals lijmen van9,10 en11,12van de frame van de hoofd gemonteerde goggle stiksel. Wij de exist hoofd gemonteerde goggle technics11,12,13 in combinatie met onze nieuw ontworpen frame te ontwikkelen van een ameliorated protocol voor robuuste en efficiënte experimentele bijziendheid in muizen inducerende. Het protocol kan worden toegepast op jonge muizen snel na het spenen op postnatale dag 21 (p21). Wij ook de processen voor stabiele en nauwkeurige evaluatie van fenotypen met inbegrip van de breking en AL geoptimaliseerd. Wij hopen dit gestandaardiseerde protocol kan helpen om kortzichtige muizen een gemakkelijker toegankelijk model voor bijziendheid onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Controleer of de bril vast te stellen stabiel op de kop van de muis, moeten verschillende stappen in dit protocol veel aandacht worden besteed. Het beenvlies moet volledig worden verwijderd voordat u de tandheelkundige zelfklevende systeem. Het bloed op de schedel ook moeten met zorg worden opgeruimd. Een beetje fijnafstelling die aanvaardbaar is direct na de toepassing van de lijm, Verplaats niet de stick vaak voordat het zelfklevend systeem opdrogen. Volg de instructie van de zelfklevende systeem zorgvuldig, met name d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken M.T. Pardue voor advies over de SDOCT, F. Schaeffel voor advies over metingen van breking en hoornvlies kromming, Mr. Sanshouo voor het herscheppen van de driedimensionale framegegevens, M. Miyauchi; K. Tsubota; Y. Tanaka; S. Kondo; C. themaoman; M. Ibuki; Y. Miwa; Y. Hagiwara; A. Ishida; Y. Tomita; Y. Katada; E. de Yotsukura; K. Takahashi; en Y. Wang voor kritische discussies. Dit werk werd gesteund door subsidies inAid voor wetenschappelijk onderzoek (KAKENHI, nummer 15K 10881) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) TK. Dit werk wordt ook ondersteund door de subsidie voor bijziendheid onderzoek van Tsubota laboratorium, Inc (Tokio).
Materials
| screw | NBK | SNZS-M1.4-10 | |
| washer | MonotaRO | 42166397 | |
| nut | MonotaRO | 42214243 | |
| stick | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| frame | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| lenses | RAINBOW CONTACT LENS | none | customized for mice use by the company |
| cyanoacrylate glue | OK MODEL | MP 20g | |
| dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | super bond | contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull |
| infrared photorefractor | Steinbeis Transfer Center | none | designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen |
| Spectral domain OCT | Leica | R4310 | |
| Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution | Santen | Mydrin-P | |
| midazolam | Sandoz K.K. | SANDOZ | components for the anesthetic |
| medetomidine | Orion Corporation | Domitor | components for the anesthetic |
| butorphanol tartrate | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | components for the anesthetic |
| 0.1 % purified sodium hyaluronate | Santen | Hyalein | |
| atipamezole hydrochloride | Zenoaq | antisedan |
References
- Dolgin, E. The myopia boom. Nature. 519 (7543), 276-278 (2015).
- Ohno-Matsui, K. Pathologic Myopia. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia, Pa). 5 (6), 415-423 (2016).
- Morgan, I. G., Ashby, R. S., Nickla, D. L. Form deprivation and lens-induced myopia: are they different. Ophthalmic & Physiological Optics. 33 (3), 355-361 (2013).
- Jiang, X., et al. A highly efficient murine model of experimental myopia. Scientific Reports. 8 (1), 2026 (2018).
- Torii, H., et al. Violet Light Exposure Can Be a Preventive Strategy Against Myopia Progression. EBioMedicine. 15, 210-219 (2017).
- Smith, E. L., et al. Effects of Long-Wavelength Lighting on Refractive Development in Infant Rhesus Monkeys. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6490-6500 (2015).
- Gawne, T. J., Siegwart, J. T., Ward, A. H., Norton, T. T. The wavelength composition and temporal modulation of ambient lighting strongly affect refractive development in young tree shrews. Experimental Eye Research. 155, 75-84 (2017).
- Wu, Y., et al. Early quantitative profiling of differential retinal protein expression in lens-induced myopia in guinea pig using fluorescence difference two-dimensional gel electrophoresis. Molecular Medicine Reports. , (2018).
- Schaeffel, F., Burkhardt, E., Howland, H. C., Williams, R. W. Measurement of refractive state and deprivation myopia in two strains of mice. Optometry and Vision Science. 81 (2), 99-110 (2004).
- Tkatchenko, T. V., Shen, Y., Tkatchenko, A. V. Mouse experimental myopia has features of primate myopia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1297-1303 (2010).
- Faulkner, A. E., Kim, M. K., Iuvone, P. M., Pardue, M. T. Head-mounted goggles for murine form deprivation myopia. Journal of Neuroscience Methods. 161 (1), 96-100 (2007).
- Gu, Y., et al. A Head-Mounted Spectacle Frame for the Study of Mouse Lens-Induced Myopia. Journal of Ophthalmology. 2016, 8497278 (2016).
- Siegwart, J. T., Norton, T. T. Goggles for controlling the visual environment of small animals. Laboratory Animal Science. 44 (3), 292-294 (1994).
- Tkatchenko, T. V., Tkatchenko, A. V. Ketamine-xylazine anesthesia causes hyperopic refractive shift in mice. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 67-71 (2010).
- Chou, T. H., et al. Postnatal elongation of eye size in DBA/2J mice compared with C57BL/6J mice: in vivo analysis with whole-eye OCT. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3604-3612 (2011).
- Park, H., et al. Assessment of axial length measurements in mouse eyes. Optometry and Vision Science. 89 (3), 296-303 (2012).
