Tilskyndelse og evaluering av en Murine modell av eksperimentelle myopi
Summary
I denne protokollen beskriver vi den fullstendige prosessen med eksperimentelle myopi tilskyndelse i mus med nydesignede briller og teknikken nødvendig for å oppnå stabil og reproduserbar resultatene i okulær parameteren målinger.
Abstract
Murine modell av myopi kan være et kraftig verktøy for nærsynthet forskning på grunn av relativt enkelt genetisk manipulering. En måte å indusere myopi i dyr er å sette klare minus linser foran øynene for uker (linse-indusert myopi, LIM). Men varierer bevarte protokoller for tilskyndelse og evaluering fra laboratoriet til laboratoriet. Her beskrev vi en svært praktisk og reproduserbar metode for å indusere LIM i mus med nydesignede briller. Metoden hurtigreparasjoner linsen stabilt foran øyet musen mens du gjør objektivet tas av for rengjøring eller aktuelle stoffet administrasjon. Fenotypen er robust og effektiv avviket er liten. Metoden beskrevet her kan brukes til mus rett etter avvenning som utvider mulig varighet for eksperimenter. Vi ga også teknisk rådgiver for å oppnå reproduserbar resultatene i brytning og aksial lengdemål. Vi håper trinnvise protokollen beskrevet her og detaljert artikkelen kan hjelpe forskerne å utføre myopi eksperimenter med myopi jevnere og gjøre dataene sammenlignbare over laboratorier.
Introduction
Utbredelsen av myopi har økt dramatisk nylig, mens mekanismen utbruddet og progresjon er fortsatt i stor grad unknow1. Mest karakteristiske fenotypen av myopi er forlengelse av aksial lengde (AL), noe som øker risikoen for retinal komplikasjoner eller blindhet2. For å bedre forstå patogenesen av myopi og utvikle effektive behandlinger, er robust nærsynt dyremodeller og stabil fenotypen evaluering nødvendig.
Kort, to metoder finnes for inducing nærsynt stater i dyr: skjema-deprivasjon myopi (FDM) og linse-indusert myopi (LIM)3. Tidligere steder diffusorer foran øyet eller sutures øyelokket skal skjule bildet, som påvirker normal utvikling av øyeeplet, noe som resulterer i en myopi fenotypen. De siste stedene minus linser foran øyet å flytte fokuspunkt bak netthinnen. Netthinnen oppdager skifte av fokus og elongates øyeeplet du justere netthinnen og samlingspunkt. Øyelokket er lukket eller diffuseren har vært fast foran øyet, for FDM kreves nesten ingen ytterligere vedlikehold. For LIM må linsen tas av for rengjøring for å holde det gjennomsiktig. Dermed er FDM relativt lett å bli indusert teknisk. Men mekanismer for FDM og LIM er forskjellige, og hvilken metode som etterligner myopi i menneskelig bedre er fortsatt under debatten3. En av styrkene til LIM er sterkere fenotypen sammenlignet med FDM, minst i mus4.
Dyr som har blitt brukt for å indusere myopi inkluderer damer5, apekatter6, tre kjerringer7, marsvin8og mus4. Vurderer muligheten for genetisk manipulasjon, rikelig tilgjengelig antistoffer og lave kostnader for formering, kunne mus vært førstevalget som dyr modell av myopi. Men er sammenlignet med andre større dyr, fikse linser eller diffusorer foran musen øyet relativt vanskelig spesielt for unge mus som rett etter venne. For eksperimentene trenger aktuell narkotikabruk administrasjon eller flere midlertidige øye mål, er det også nødvendig for rammen fjernes. En annen utfordring er små morfologiske endring av musen øyeeplet, som trenger enheter å evaluere og sofistikert technics. Hittil har gjør forskjellige inducing og måle protokoller som brukes i forskjellige forskergrupper det vanskelig å sammenligne og gjenta resultatene over laboratorier. En standardprotokoll detaljer er nødvendig.
Tidligere arbeider beskrives flere metoder å fastsette linser eller diffusorer foran musen øyet, for eksempel liming9, søm10 og hode montert goggle ramme11,12. Vi kombinerte eksisterer hode montert goggle technics11,12,13 med våre nydesignede ramme å utvikle en ameliorated protokoll for inducing robust og effektiv eksperimentelle myopi i mus. Protokollen kan brukes til små mus snart etter venne på postnatal dag 21 (p21). Vi har også optimalisert prosessene for stabil og nøyaktig vurdering av fenotyper inkludert brytning og AL. Vi håper denne standardisert protokollen kan hjelpe for å lage nærsynt mus en lettere tilgjengelig modell for nærsynthet forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sikre briller fikses stabilt på mus hodet, må flere trinn i denne protokollen være betalt stor oppmerksomhet. Periosteum må fjernes helt før du bruker det dental lim systemet. Blod på skallen også må renses opp med forsiktighet. Mens litt finjustering er akseptabel rett etter limet, flyttes ikke pinne ofte før limet tørker opp. Følg instruksjonen av det lim systemet nøye, spesielt forholdet mellom hver komponent av endelige blandingen. Forstå når musen under vedlikehold av briller eller oppfølging målene …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mt Pardue for råd om SDOCT, F. Schaeffel for råd om målinger av brytning og hornhinnen kurvatur, Mr. Sanshouo for å gjenskape tredimensjonale ramme dataene, M. Miyauchi; K. Tsubota; Y. Tanaka; S. Kondo; C. Shoda; M. Ibuki; Y. Miwa; Y. Hagiwara; A. Ishida; Y. Tomita; Y. Katada; E. Yotsukura; K. Takahashi; og Y. Wang for kritiske diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd inAid for vitenskapelig forskning (KAKENHI, nummer 15K 10881) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) til TK. Dette arbeidet er også støttet av stipendet for nærsynthet forskning fra Tsubota Laboratory, Inc. (Tokyo Japan).
Materials
| screw | NBK | SNZS-M1.4-10 | |
| washer | MonotaRO | 42166397 | |
| nut | MonotaRO | 42214243 | |
| stick | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| frame | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| lenses | RAINBOW CONTACT LENS | none | customized for mice use by the company |
| cyanoacrylate glue | OK MODEL | MP 20g | |
| dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | super bond | contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull |
| infrared photorefractor | Steinbeis Transfer Center | none | designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen |
| Spectral domain OCT | Leica | R4310 | |
| Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution | Santen | Mydrin-P | |
| midazolam | Sandoz K.K. | SANDOZ | components for the anesthetic |
| medetomidine | Orion Corporation | Domitor | components for the anesthetic |
| butorphanol tartrate | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | components for the anesthetic |
| 0.1 % purified sodium hyaluronate | Santen | Hyalein | |
| atipamezole hydrochloride | Zenoaq | antisedan |
References
- Dolgin, E. The myopia boom. Nature. 519 (7543), 276-278 (2015).
- Ohno-Matsui, K. Pathologic Myopia. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia, Pa). 5 (6), 415-423 (2016).
- Morgan, I. G., Ashby, R. S., Nickla, D. L. Form deprivation and lens-induced myopia: are they different. Ophthalmic & Physiological Optics. 33 (3), 355-361 (2013).
- Jiang, X., et al. A highly efficient murine model of experimental myopia. Scientific Reports. 8 (1), 2026 (2018).
- Torii, H., et al. Violet Light Exposure Can Be a Preventive Strategy Against Myopia Progression. EBioMedicine. 15, 210-219 (2017).
- Smith, E. L., et al. Effects of Long-Wavelength Lighting on Refractive Development in Infant Rhesus Monkeys. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6490-6500 (2015).
- Gawne, T. J., Siegwart, J. T., Ward, A. H., Norton, T. T. The wavelength composition and temporal modulation of ambient lighting strongly affect refractive development in young tree shrews. Experimental Eye Research. 155, 75-84 (2017).
- Wu, Y., et al. Early quantitative profiling of differential retinal protein expression in lens-induced myopia in guinea pig using fluorescence difference two-dimensional gel electrophoresis. Molecular Medicine Reports. , (2018).
- Schaeffel, F., Burkhardt, E., Howland, H. C., Williams, R. W. Measurement of refractive state and deprivation myopia in two strains of mice. Optometry and Vision Science. 81 (2), 99-110 (2004).
- Tkatchenko, T. V., Shen, Y., Tkatchenko, A. V. Mouse experimental myopia has features of primate myopia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1297-1303 (2010).
- Faulkner, A. E., Kim, M. K., Iuvone, P. M., Pardue, M. T. Head-mounted goggles for murine form deprivation myopia. Journal of Neuroscience Methods. 161 (1), 96-100 (2007).
- Gu, Y., et al. A Head-Mounted Spectacle Frame for the Study of Mouse Lens-Induced Myopia. Journal of Ophthalmology. 2016, 8497278 (2016).
- Siegwart, J. T., Norton, T. T. Goggles for controlling the visual environment of small animals. Laboratory Animal Science. 44 (3), 292-294 (1994).
- Tkatchenko, T. V., Tkatchenko, A. V. Ketamine-xylazine anesthesia causes hyperopic refractive shift in mice. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 67-71 (2010).
- Chou, T. H., et al. Postnatal elongation of eye size in DBA/2J mice compared with C57BL/6J mice: in vivo analysis with whole-eye OCT. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3604-3612 (2011).
- Park, H., et al. Assessment of axial length measurements in mouse eyes. Optometry and Vision Science. 89 (3), 296-303 (2012).
