Uppmuntran och utvärdering av en murin modell av experimentella närsynthet
Summary
I detta protokoll beskriver vi hela processen med experimentella myopi uppmuntran i möss med nydesignade glasögon och technic behövs för att uppnå stabila och reproducerbara resultat i okulär parametern mätningar.
Abstract
Murina modell av närsynthet kan vara ett kraftfullt verktyg för närsynthet forskning på grund av de jämförelsevis lätt genetisk manipulationen. Ett sätt att framkalla närsynthet hos djur är att sätta tydliga minus linser framför ögonen i veckor (lins-inducerad myopi, LIM). Bevarade protokoll för uppmuntran och utvärdering varierar dock från laboratorium till laboratorium. Vi beskrivit här, en mycket praktisk och reproducerbar metod för att framkalla LIM i möss med nydesignade glasögon. Metoden korrigeringar linsen stabilt framför musen ögat samtidigt tillåter linsen tas bort för rengöring eller utvärtes drug administration. Fenotypen är robusta och effektiva, och variansen är liten. Den metod som beskrivs här kan tillämpas på möss direkt efter avvänjning som sträcker sig hela möjligt för experiment. Vi gav också teknisk rådgivare för att uppnå reproducerbara resultat i refraktion och axiell längd mätningar. Vi hoppas det stegvisa protokollet som beskrivs här och detaljerade artikeln kan hjälpa forskare utföra myopi experiment med närsynthet smidigare och göra uppgifterna jämförbara över laboratorier.
Introduction
Förekomsten av myopi har ökat dramatiskt nyligen, medan mekanismen av dess debut och progression är fortfarande till stor del okänd1. Den mest karakteristiska fenotypen av närsynthet är förlängningen av axiell längd (AL), vilket ökar risken för retinal komplikationer eller blindhet2. Att bättre förstå patogenesen av myopi och utveckla effektiva behandlingar, är robust närsynta djurmodeller och stabil fenotyp utvärdering nödvändig.
Kort, finns två metoder för att inducera närsynta stater i djur: form-deprivation myopi (FDM) och objektiv-inducerad myopi (LIM)3. De tidigare förlägger diffusorer framför ögat eller sutures ögonlocket för att skymma bilden, som påverkar den normala utvecklingen av ögongloben, vilket resulterar i en myopi fenotyp. De sistnämnda platserna minus linser framför ögat att flytta tyngdpunkten bakom näthinnan. Näthinnan upptäcker en förskjutning av fokus och förlänger ögongloben för att justera näthinnan och samlingspunkt. FDM, efter ögonlocket är stängd eller spridaren har fixats framför ögat, behövs nästan inget ytterligare underhåll. För LIM behöver linsen tas bort för rengöring för att hålla det öppet. Således, FDM är relativt lätt att induceras tekniskt. Dock mekanismer FDM och LIM är olika, och vilken metod härmar myopi i mänskliga bättre är fortfarande under debatt3. En av styrkorna med LIM är starkare fenotypen jämfört med FDM, åtminstone när det gäller möss4.
Djur som har använts för att inducera myopi inkluderar kycklingar5, apor6, tree näbbmöss7, marsvin8och möss4. Med tanke på möjligheten att genmanipulation, rikligt tillgängliga antikroppar och låg kostnad för avel, kunde möss ha varit förstahandsvalet som djur modell av närsynthet. Jämfört med andra större djur, är fastställande linser eller diffusorer framför musen ögat dock relativt svårt särskilt för unga möss såsom rätt efter avvänjning. För experiment som behöver aktuell drug administration eller flera mellanliggande ögat mätningar, är det också nödvändigt för ramen för att vara flyttbar. En annan utmaning är den små morfologiska förändringen av mus ögonglob, som måste sofistikerade technics och enheter att utvärdera. Hittills har gör olika inducerande och mäta protokoll som används i olika forskargrupper det svårt att jämföra och upprepa resultaten i laboratorier. Ett standardprotokoll med detaljer som behövs.
Tidigare verk beskrivs flera metoder för att fixa linser eller diffusorer framför musen ögat, såsom limning9, sy10 och huvud-monterad goggle ram11,12. Vi kombinerade finns huvud-monterad goggle technics11,12,13 med vår nydesignade ram att utveckla ett ameliorated protokoll för att inducera robusta och effektiva experimentella närsynthet hos möss. Protokollet kan tillämpas på unga möss snart efter avvänjning postnatal dag 21 (p21). Vi har också optimerat processerna för stabil och exakt utvärdering av fenotyper inklusive refraktion och AL. Vi hoppas detta standardiserade protokoll kan bidra till att göra närsynta möss en mer lättillgänglig modell för närsynthet forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kontrollera att glasögon ska fästas stabilt på mus huvudet genom behöver flera steg i detta protokoll ägnas stor uppmärksamhet. Periostet måste tas bort helt innan du använder den dentala limsystem. Blod på skallen behöver också städas upp med omsorg. Medan en liten finjustering är acceptabel direkt efter tillämpningen av limmet, flytta inte pinnen ofta innan självhäftande systemet torka upp. Följ anvisningen av självhäftande systemet noggrant, särskilt förhållandet mellan varje komponent i den slut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar MT Pardue för råd om SDOCT, F. Schaeffel för råd om mätningar av refraktion och hornhinnans krökning, Mr Sanshouo för att återskapa den tredimensionella ramdata, M. Miyauchi; K. Tsubota; Y. Tanaka; S. Kondo; C. Shoda; M. Ibuki; Y. Miwa; Y. Hagiwara; A. Ishida; Y. Tomita; Y. Katada; E. Yotsukura; K. Takahashi; och Y. Wang för kritiska diskussioner. Detta arbete stöds av bidrag inAid för vetenskaplig forskning (KAKENHI, nummer 15K 10881) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT) till TK. Detta arbete stöds också av bidraget för närsynthet forskning från Tsubota Laboratory, Inc. (Tokyo Japan).
Materials
| screw | NBK | SNZS-M1.4-10 | |
| washer | MonotaRO | 42166397 | |
| nut | MonotaRO | 42214243 | |
| stick | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| frame | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| lenses | RAINBOW CONTACT LENS | none | customized for mice use by the company |
| cyanoacrylate glue | OK MODEL | MP 20g | |
| dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | super bond | contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull |
| infrared photorefractor | Steinbeis Transfer Center | none | designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen |
| Spectral domain OCT | Leica | R4310 | |
| Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution | Santen | Mydrin-P | |
| midazolam | Sandoz K.K. | SANDOZ | components for the anesthetic |
| medetomidine | Orion Corporation | Domitor | components for the anesthetic |
| butorphanol tartrate | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | components for the anesthetic |
| 0.1 % purified sodium hyaluronate | Santen | Hyalein | |
| atipamezole hydrochloride | Zenoaq | antisedan |
References
- Dolgin, E. The myopia boom. Nature. 519 (7543), 276-278 (2015).
- Ohno-Matsui, K. Pathologic Myopia. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia, Pa). 5 (6), 415-423 (2016).
- Morgan, I. G., Ashby, R. S., Nickla, D. L. Form deprivation and lens-induced myopia: are they different. Ophthalmic & Physiological Optics. 33 (3), 355-361 (2013).
- Jiang, X., et al. A highly efficient murine model of experimental myopia. Scientific Reports. 8 (1), 2026 (2018).
- Torii, H., et al. Violet Light Exposure Can Be a Preventive Strategy Against Myopia Progression. EBioMedicine. 15, 210-219 (2017).
- Smith, E. L., et al. Effects of Long-Wavelength Lighting on Refractive Development in Infant Rhesus Monkeys. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6490-6500 (2015).
- Gawne, T. J., Siegwart, J. T., Ward, A. H., Norton, T. T. The wavelength composition and temporal modulation of ambient lighting strongly affect refractive development in young tree shrews. Experimental Eye Research. 155, 75-84 (2017).
- Wu, Y., et al. Early quantitative profiling of differential retinal protein expression in lens-induced myopia in guinea pig using fluorescence difference two-dimensional gel electrophoresis. Molecular Medicine Reports. , (2018).
- Schaeffel, F., Burkhardt, E., Howland, H. C., Williams, R. W. Measurement of refractive state and deprivation myopia in two strains of mice. Optometry and Vision Science. 81 (2), 99-110 (2004).
- Tkatchenko, T. V., Shen, Y., Tkatchenko, A. V. Mouse experimental myopia has features of primate myopia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1297-1303 (2010).
- Faulkner, A. E., Kim, M. K., Iuvone, P. M., Pardue, M. T. Head-mounted goggles for murine form deprivation myopia. Journal of Neuroscience Methods. 161 (1), 96-100 (2007).
- Gu, Y., et al. A Head-Mounted Spectacle Frame for the Study of Mouse Lens-Induced Myopia. Journal of Ophthalmology. 2016, 8497278 (2016).
- Siegwart, J. T., Norton, T. T. Goggles for controlling the visual environment of small animals. Laboratory Animal Science. 44 (3), 292-294 (1994).
- Tkatchenko, T. V., Tkatchenko, A. V. Ketamine-xylazine anesthesia causes hyperopic refractive shift in mice. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 67-71 (2010).
- Chou, T. H., et al. Postnatal elongation of eye size in DBA/2J mice compared with C57BL/6J mice: in vivo analysis with whole-eye OCT. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3604-3612 (2011).
- Park, H., et al. Assessment of axial length measurements in mouse eyes. Optometry and Vision Science. 89 (3), 296-303 (2012).
