免疫荧光定量小鼠脑突触蛋白的异种分布
Summary
在这里, 我们描述了一种定量的方法来确定突触蛋白相对于标记蛋白使用免疫荧光染色, 共聚焦显微镜, 和基于计算机的分析。
Abstract
特定突触蛋白的存在、缺失或水平会严重影响突触的传播。除了阐明蛋白质的功能外, 还必须确定其分布。在这里, 我们描述了一个使用免疫荧光、共聚焦显微镜和基于计算机的分析来确定突触蛋白 mof (也称为 tprgl 或 synaptic) 的分布的协议。我们比较了切除物与突触泡蛋白突触素的分布, 从而定量地确定了运动物相对于突触囊泡丰度的分布。值得注意的是, 这种方法有可能被采用, 以便利用不同的抗体或显微镜或在不同的研究中比较蛋白质的分布。我们的方法通过产生比而不是绝对荧光水平来规避免疫荧光污渍的固有变异性。此外, 我们描述的方法使研究人员能够分析蛋白质在不同层次上的分布: 从整个大脑切片到大脑区域, 再到大脑区域的不同次区域, 如海马或感觉的不同层皮层。马剂是一种脊椎动物特有的蛋白质, 与突触囊泡有关。通过这种方法, 我们表明, 蒙特是异质分布在大脑的各个区域, 在腹侧苍白, 隔膜核, 杏仁核的高水平, 也在单个大脑区域, 如海马的不同层。
Introduction
神经元之间的通信发生在称为突触的特殊接触点。突触包含无数不同的蛋白质, 这些蛋白质协调着突触的传递。其中一些蛋白质在整个神经系统中表现出异质分布, 并不是在每个突触1中都存在。这种蛋白质的一个例子是 munc13, 它参与了突触囊泡的启动过程。munc13 有不同的等形, 它们在整个大脑中分布不均, 而特定等形的存在或不存在会影响短期突触可塑性和突触囊动力学3,4 个,5. 因此, 能够识别大脑各区域存在不同的突触蛋白至关重要。
突触蛋白的定量选择方法–到目前为止–是质谱和西方印迹, 而不是免疫组织化学 6,7,8,9。在某些情况下, 有几种方法相互补充, 以评估特定蛋白质的数量和定位 (即wilhelm等人).10). 我们在这里描述的方法允许对感兴趣的蛋白质进行定位和定量, 而无需使用任何生化方法, 只需使用免疫荧光污渍。这里的另一个优点是, 量化可以在比其他方法实现的更小的区域上进行, 因此也可以更具体。然而, 人们必须考虑到, 需要一种可靠的参考蛋白质来评估感兴趣的蛋白质的分布。
免疫组织化学的荧光染色使我们能够例行识别蛋白质在大脑区域以及不同神经元隔间内的定位。若要标识不同的隔间, 请使用特定标记。通常情况下, 抗突触素和突触素11的抗体可用于标记突触囊泡, 而针对巴松突的抗体标记突触前端子 12的活动区。水泡转运体, 如水泡谷氨酸转运体 (vglot) 或水泡 gaba 转运体 (vgat), 分别用于标记兴奋13 和抑制性 14前突触前端子。在突触后, 针对荷马蛋白的抗体可用于标记突触后端子, 而针对突触后密度蛋白 95 (psd95)15、16、17或 gephyrin18的抗体可用于标记突触后端子。,19,20可分别标记兴奋或抑制突触后端子。通过对感兴趣的蛋白质和标记 (如上面描述的) 使用抗体, 可以确定这种蛋白质的定位。迄今为止, 许多研究都以定性的方式做到了这一点。然而, 要可靠地确定特定突触蛋白的差异分布, 不仅必须确定其存在或缺失, 还必须确定其相对浓度。突触的大小和密度的异质性使得建立突触标记和感兴趣的蛋白质之间的比例变得很重要。否则, 突触丰富的区域, 如海马的非锥体层和小脑的分子层, 将显示突触蛋白的高密度, 这只是由于突触的密度较高, 但不是由于该蛋白的强大存在每个突触 (例如, wallrafen 和 dresbach1)。另一方面, 由于神经元细胞体浓度高, 神经元 soma 中的蛋白质 (例如tgn38 22) 通常会在海马锥体细胞层或海马或小脑颗粒层中显示出强烈的存在在这些地区。因此, 这种结构的非均匀分布, 在这种情况下是突触, 会导致对感兴趣的蛋白质本身的分布的错误估计。此外, 免疫组织化学污渍样品的染色强度存在内在差异。这里描述的协议考虑到了这一点, 避免了这种偏见, 以及免疫组织化学方法引起的其他警告。
在我们最近的研究中, 我们用这种方法来描述 mof (也称为 tprgl23或 sap3024) 在16个不同大脑区域1的差异表达。m接管是一种脊椎动物特异性突触蛋白, 可与突触囊泡有关, 并影响神经递质释放25,26,27.我们有相关的运动表达突触囊的丰富, 通过染色突触素作为突触囊参考标记。我们发现了高水平的 mof, 特别是在隔膜核, 腹侧苍白, 和杏仁核。在海马区内, 我们发现了一个均匀分布的 mof, 与海马内计算相关的层数较高, 在输入和输出层的水平较低。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里提出的方法是量化感兴趣的蛋白质相对于已知分布的标记蛋白的丰度的分布。免疫荧光染色可显示不同切片之间染色强度的高变异性。这里描述的量化方法通过确定整个半球感兴趣的蛋白质与平均值的比率来规避这个问题。因此, 不同切片的染色强度被取消, 并允许定量描述。
与每一个免疫荧光协议一样, 定性或定量, 有几个因素会影响成功, 从而混淆分析。因此, 应特别?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 irmgard weiss 提供的出色技术援助。提交人感谢 hermes pofantis 和 andoniya petkova 的支持。作者还感谢欧洲神经科学研究所使用 lsm800 和技术援助, 特别是 nils halbsteut 博士提供的技术援助。这项工作是由哥廷根大学医学中心资助的。jsv 感谢大脑纳米显微镜和分子生理学中心 (cnmpb) 的支持。
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
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